桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析

目的：克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA，为研究其结构和功能的关系。并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础。方法：从五步蛇蛇腺中提取了总RNA，通过反转录合成第一链cDNA，经PCR扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段，并将其连接到质粒载体扩增，然后进行DNA测序。结果：成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段。此片段全长794bp，包括编码部分的全长为777bp。推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸，其中包括18个氨基酸的信号肽，6个氨基权的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序。TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比，蛋白质一级结构具有较高的同源性。结论：从五步蛇中成功克隆出一 种新的类凝血酶cDNA，并确定了它的DNA顺序。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的：为制备基因工程抗体，需要对组织蛋白酶B单抗可变区基因的核苷酸序列进行分析。方法：利用RT-PCR技术扩增2A2抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因，测序并和已报道的小鼠免疫球蛋白的基因库进行比较。结果：2A2抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析及比较结果没有发现有害的基因突变。结论：2A2抗组织蛋白酶可变区基因可用于构建人鼠嵌合抗体。     

基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂与脑血管病的关系

细胞外基质（ECM）是一种多能蛋白和糖蛋白的复合体，基质金属蛋白酶（MMP）是一种降解基底膜（ECM）成分的锌依赖性酶，该酶与脑缺血和再灌注有密切关系。组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP），可减轻缺血和再灌注损伤。本就MMP和TIMP在脑缺血时表达和作用进行系统概述 。     

金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP—1）的克隆与序列分析

目的：用基因工程技术构建金属蛋白酶组织抑制剂的克隆质粒。方法：从人乳腺癌细胞中分离提取总RNA,经逆转录PCR（RT－PCR）扩增出金属蛋白酶抑制因子1（TIMP－1）的c DNA,插入经NdeI和XhoI双酶切的PET19b载体中,构建了克隆质粒PET19bTIMP－1。结果：对此克隆质粒进行了限制性酶切鉴定和DNA序列分析,结果在扩增出的cDNA中624个碱基中与发表的TIMP－1cDNA序列相比,除361位碱基由A变为G外,其余均完全相同。结论：该突变导致编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸,不影响本课题后期用该克隆化基因表达蛋白作为抗原制备单克隆抗体的目的。该DNA全长624bp,编码207个氨基酸。     

人hole基因的克隆和序列分析

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

基质金属蛋白酶-9及其组织金属蛋白酶抑制剂与大肠癌侵袭和转移的关系研究

目的 研究基质金属蛋白酶（MMP-9）及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）与大肠癌侵袭和转移的关系.方法 对30例大肠癌患者的手术切除之癌组织和癌周正常组织,应用Western blot分析的方法检测MMP-9和TIMP-1的表达情况,探讨这些因子表达与大肠癌侵袭和转移的关系.结果 大肠癌组织中MMP-9的表达量明显高于正常组织（P＜0.05）;TIMP-1的表达量则明显低于正常组织（P＜0.05）;伴淋巴结转移的大肠癌组织中MMP-9和TIMP-1的表达量均明显高于无淋巴结转移者（P＜0.05）;随着肿瘤Dukes分期的进展,MMP-9和TIMP-1的表达量均逐渐升高.结论 大肠癌中MMP-9、TIMP-1的表达,可能是癌肿发生、生长和浸润转移的重要因素,可作为判断肿瘤恶性程度和预后的重要指标. 纤维支气管镜检查慢性咳嗽63例 目的 探讨纤维支气管镜（纤支镜）在胸部X线检查正常的慢性咳嗽患者病因诊断中的作用.方法 回顾分析2003年7月-2006年7月胸部X线检查正常的63例慢性咳嗽患者纤支镜所见,镜下活检,刷检和肺泡灌洗术的病理及细菌学检查结果.结果 63例患者中,镜下观察到鼻息肉2例（3.2%）,鼻甲肥厚2例（3.2%）,鼻腔粘膜暗红、增厚3例（4.8%）,咽隐窝和咽后壁较多粘液附着3例（4.8%）,咽后壁滤泡增生呈鹅卵样观4例（6.3%）,鼻窦口见脓液、充血肿胀2例（3.2%）,声带结节1例（1.6%）,支气管粘膜轻度充血8例（12.7%）,局部支气管粘膜充血肿胀4例（6.3%）,局部管腔狭窄4例（6.3%）,新生物3例（4.8%）,小结节2例（3.2%）,局部见白色附着物1例（1.6%）,未见异常24例（38.1%）.找到抗酸杆菌4例（6.3%）,找到革兰阳性或革兰阴性细菌6例（9.5%）,其中细菌培养出菌株5株,找到真菌2例（3.2%）,找到癌细胞4例（6.3%）.结论 纤支镜对胸部X线检查正常的慢性咳嗽患者的病因诊断有重要意义,可提高诊断的准确性,减少误诊. 纤维支气管镜;慢性咳嗽;病因;诊断 基质金属蛋白酶-9、组织金属蛋白酶抑制剂-1在喉癌中的表达及其临床意义 目的 探讨基质金属蛋白酶（MMP-9）及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）二种蛋白在喉癌中的表达及其临床意义.方法 应用流式细胞术检测50例原发喉癌患者新鲜手术切除癌组织及50例相应癌旁组织（距肿瘤边缘0.5cm）与16例非喉部疾病患者的正常喉粘膜组织中MMP-7、MMP-9及TIMP-1的表达.结果 MMP-9在喉癌组织中的表达量（FI=1.24±0.15）及阳性表达率（100%）明显高于癌旁组织（FI=1.05±0.12）（72%）和正常粘膜组织（FI=1.0±0.02）（0%）,比较差异均有统计学意义（P＜0.01）.TIMP-1在喉癌组织中的表达量（FI=0.85±0.16）及阳性表达率（56%）明显低于癌旁组织中的表达量[FI=0.97±0.18,（84%）]和正常喉粘膜组织[FI=1.0±0.13,（88%）],比较差异均有统计学意义（P＜0.01）;MMP-9及TIMP-1在癌旁组织和正常喉粘膜组织间的表达差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 在喉癌组织中,MMP-9的高表达和TIMP1低表达在喉癌的发生、发展、转移过程中有重要作用,二者联合检测对喉癌的预后评估可能更有价值,并且为临床治疗提供理论指导. 喉癌;基质金属蛋白酶-9;组织金属蛋白酶抑制剂-1;流式细胞术;细胞外基质 肝切除联合纤维胆道镜辅助治疗肝内胆管结石 目的 探讨肝切除联合纤维胆道镜治疗肝内胆管结石的疗效.方法 回顾性分析2001-2006年经肝切除并配合术中及术后胆道镜处理的105例肝内胆管结石病例.结果 105例患者均行相应的肝叶（段）切除和术中胆道镜取石,31例（29.5%）术后有残余结石,术后胆道镜残余结石总取净率为80.6%,105例患者总治愈率为94.3%（99/105）,总残石率为5.7%（6/105）.结论 肝切除联合纤维胆道镜是治疗肝内胆管结石的一种有效方法,纤维胆道镜在处理肝内胆管结石中起到了重要作用. 肝切除;纤维胆道镜;胆结石     

基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9主要基因位点多态性与缺血性脑血管病的相关性分析

目的：研究基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因位点多态性及血清Vaspin、Chemerin与缺血性脑血管病的相关性。方法：选取短暂性脑缺血发作(TIA)患者100例以及急性脑卒中患者100例为研究对象,分别为TIA组及卒中组。另选取同期接受体检的健康志愿者100例作为对照组。比较三组人员血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析明确上述血清学指标诊断TIA的效能。此外,通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法检测3组人员MMP-1、MMP-3及MMP-9基因多态性的差异。检测并比较三组血清Vaspin及Chemerin水平。结果：TIA组血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水分别为(122.34±8.15)μg/L、(93.21±8.03)μg/L、(132.74±8.37)μg/L,明显高于卒中组的(86.83±6.29)μg/L、(57.22±5.71)μg/L、(110.42±5.23)μg/L,且卒中组上述各项指标水平均高于对照组(均P<0...     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶对动物凝血功能的影响

目的：探讨尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme，NHFLE)对动物凝血功能的影响。方法：用动物体内外实验方法观察NHFLE对富血小板血浆中经ADP诱导的血小板聚集的影响及NHFLE对凝血功能的影响。结果：NHFLE能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间，产生抗凝作用。动物体内注射NHFLE后血浆纤维蛋白原含量降低，优球蛋白的溶解时间缩短。结论：尖吻蝮蛇毒NHFLE对动物的凝血功能有影响，具有明显的抗凝作用。     

尖吻蝮蛇毒的神经毒性作用

以离体蟾蜍交感神经节作为实验模型,用细胞內电记录技术检测出尖吻蝮(五步蛇)蛇毒具有阻抑交感神经节烟碱型胆碱能性突触传递作用。这种抑制至少部分是通过突触后机制而起作用的。本文报告的AAV具有神经毒性,为解释尖吻蝮蛇伤患者呼吸肌乏力、麻痹提供了理论依据。     

器官灌流法对蛇毒引起狗DIC的鉴别作用

尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom,AAV)引起狗实验性DIC,並对肺、肾两脏器进行灌流。组织经常规制片,HE、PTAH及MSB染色后,光镜下观察,表明器官灌流法对降低DIC的假阳性具有一定作用,并能提高组织结构的清晰度。     

中国蕲蛇毒的临床应用

本文对心血管疾病行体外循环者、肝病、肾病及弥漫性血管内凝血的病人,作了中国蕲蛇毒时间的检查,证明中国蕲蛇毒时间不受肝素的影响,对凝血酶时间延长、异常纤维蛋白原血症等的诊断与鉴别诊断有一定的价值。     

中药混乱品种鉴别研究——7. 蕲蛇及其混淆品鉴别之二

作者前已报道蕲蛇及其伪品滑鼠蛇的鉴别,又据报道有些省发现蕲蛇商品药材中混有烙铁头、山烙铁头两种蛇的干燥体。作者对这两种混淆品与蕲蛇在体表花纹、鳞片以及骨骼的形态与组织特征等方面进行了鉴别研究。     

长白白眉蝮蛇类凝血酶的研究Ⅱ：理化,酶学性质的鉴定

长白白眉蝮蛇类凝血酶分子量为39 000,是一种糖蛋白。氨基酸组成分析表明,此酶共含303个氨基酸残基,其中酸性氨基酸含量较高,等电点为4.25。该酶对BAEE(苯甲酰-L-精氨酸乙酯)水解活力的最适pH值为8左右,Km为3.53×10~(-4)mol/L,其活性可被DFP(二异丙基氟磷酸)及PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制。催化降解纤维蛋白原过程中,只释放纤肽A,不释放纤肽B,形成的纤维蛋白可被5 mol/L尿素液溶解。