骨保护素对破骨细胞分化和骨吸收活性的抑制作用

背景：骨保护素(osteoprotegerin，OPG)可抑制破骨细胞的分化，抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡，在骨质疏松、类风湿性关节炎、癌症骨转移的领域有潜在的应用价值。目的：鉴定在CHO细胞中表达的人骨保护素生物学活性。设计：随机对照的实验研究。地点和对象：实验在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所完成，研究对象：人骨肉瘤细胞株MG63、中国仓鼠CHO细胞株、克隆质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3为本室保存，12只6～8周龄BABL／c雄性小鼠由本校动物中心提供。干预：RT-PCR法获得人OPG编码区cDNA并构建真核表达载体，在脂质体介导下转染CHO细胞，经Western blot鉴定筛选稳定表达OPG的细胞系。获取含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液，实验组：体外培养的鼠破骨细胞培养基中加人含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液。对照组1只加入转染pcDNA3空载体的CHO细胞培养基的浓缩液。对照组2只加入完全培养基。主要观察指标：观察人OPG对破骨细胞的分化和骨吸收的影响。结果：转染人OPG编码区基因的CHO细胞能分泌表达OPG。小鼠骨髓细胞在la，25(OH)zD3(1&;#215;10^-8mol／L)的存在下可稳定分化出具有骨吸收功能的破骨细胞样细胞，在该培养体系中加入含有OPG的CHO细胞培养上清浓缩液，TRAP染色阳性细胞数明显减少(t=5．547，p&;lt;0．01)，骨吸收陷窝的数量显著减少(t=3．409，P&;lt;0．01)。结论：人骨保护素可在CHO细胞中分泌表达，并对体外培养状态下的破骨细胞的分化和骨吸收功能有抑制作用。     

获得性免疫细胞在骨破坏中的作用机制

获得性免疫细胞与破骨细胞间存在广泛、复杂的相互作用,主要通过骨保护素(OPG)/核因子κB受体活化因子配体(RANKL)/核因子κB受体活化因子(RANK)系统(简称OPG/RANKL/RANK系统)调控破骨细胞的分化、成熟。TH17细胞可通过分泌IL-17,刺激破骨细胞生成,导致骨质疏松、自身免疫性关节病等。调节性T细胞(Treg)则可抑制破骨细胞活性。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和RANKL存在时,B细胞可促进破骨细胞的分化成熟;但外周血中B细胞分泌的TGF-β和OPG又可抑制破骨细胞的活性。因此,获得性免疫细胞在骨破坏中发挥重要作用。该文就获得性免疫细胞在骨破坏中作用机制的研究进展作一综述。     

基因治疗骨质疏松、骨转移癌的可行性研究

目的研究人骨保护素(OPG)转染小鼠胚胎成肌细胞C2C12后细胞形态及细胞周期的变化。方法采用Westernblot方法证实OPG在真核细胞中表达。对稳定转染OPG基因的C2C12细胞的形态、细胞周期等进行检测。结果成功克隆了人OPG编码区基因并构建了真核表达载体pcDNA3－OPG。结论人OPG编码区基因稳定转染的小鼠胚胎成肌细胞生长状态良好,DNA合成旺盛,无诱导细胞凋亡现象,为采用OPG基因治疗骨质疏松、骨转移癌等的可行性提供了依据。     

脂质体法pcDNA3-TK质粒转染胶质瘤细胞C6

目的:构建含有tk基因的真核表达载体,并转染C6细胞株建立其表达系统,为探索胶质瘤的基因治疗奠定实验基础.方法:通过酶切pSNAV2.0-TK和pcDNA3分别获得目的基因tk片段及pcDNA3片段,将目的基因插入载体相应的酶切位点,构建pcDNA3-TK质粒.酶切鉴定后采用脂质体法瞬时转染C6细胞,RT-PCR检测tk基因在细胞中的表达.结果:pcDNA3-TK质粒构建成功并顺利导入C6细胞中.结论:构建的pcDNA3-TK质粒能够在转染的C6细胞中稳定、持续和高效地表达.     

补骨脂素干预大鼠成骨细胞骨保护素/核因子kB受体激活因子配体mRNA的表达

背景:补骨脂素有促进大鼠成骨细胞增殖与分化的作用,但其作用机制尚不明确.目的:探讨补骨脂素对大鼠成骨细胞中骨保护索(osteopomgeterin,OPG)和核因子kB受体激活因子配体(receptor activator nuclear factor kappa b ligand,RANKL)mRNA表达的影响.方法:取第3代生长状况良好的出生24 h内的SD大鼠成骨细胞,补骨脂素组加入1×10-7 mol/L的补骨脂素,雌二醇组加入1×107 mol/L的雌二醇,对照组正常培养.给药72 h后提取细胞总RNA,RT-PCR方法分析细胞OPG/RANKL mRNA的表达.结果与结论:与对照组比较,补骨脂素组和雌二醇组OPG mRNA的表达均明显增加(P＜0.05),而RANKL mRNA的表达明显下降(P＜0.05),但补骨脂索组成骨细胞OPG mRNA的表达较雌二醇组弱(P＜0.05),VOPG/VRANKL 比值也较雌二醇组小(P＜0.05).说明补骨脂素可能通过增加成骨细胞OPG的表达,抑制RANKL的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟,从而抑制骨吸收,达到防治骨质疏松症的日的,但作用不如雌二醇明显.     

不同剂量骨保护素对破骨细胞内一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶的影响

背景：骨保护素和一氧化氮在防治骨质疏松方面有重要作用,但目前关于两者在抑制破骨细胞增殖分化方面的关系研究较少。
　　目的：验证不同剂量的骨保护素对破骨细胞内生成一氧化氮量及内皮型一氧化氮合酶活性的影响。
　　方法：用抗酒石酸酸性磷酸酶染色验证诱导生成的破骨细胞;将诱导生成的破骨细胞分成6个组,空白对照组不加任何试剂;阴性对照组培养液中加入培养液;骨保护素组分为4组分别加入10,25,50,75μg/L不同剂量的骨保护素试剂。采用Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒,利用流式细胞仪测定破骨细胞凋亡率;荧光定量PCR检测破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA及蛋白激酶K mRNA 的表达量变化;一氧化氮检测试剂盒检测破骨细胞中内一氧化氮浓度;内皮型一氧化氮合成酶活力试剂盒检测破骨细胞内一氧化氮合酶的活力;骨保护素各组加入内皮细胞型一氧化氮合酶抑制剂;荧光定量PCR检测破骨细胞特异性酶抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA及蛋白激酶K mRNA表达量的变化。
　　结果与结论：①骨保护素可以抑制破骨细胞的分化生成并诱导其凋亡。②骨保护素的质量浓度与诱导生成的破骨细胞数量及其标志酶mRNA的表达量呈负相关,与破骨细胞凋亡率呈正相关。③骨保护素可以增加破骨细胞内一氧化氮的生成以及内皮型一氧化氮合酶活性的升高;骨保护素的质量浓度与破骨细胞生成的一氧化氮浓度及内皮型一氧化氮合酶活性呈正相关。④Raw264.7细胞在体外培养条件下,骨保护素与一氧化氮在抑制破骨细胞生成及促进其凋亡方面有协同作用,推测两者之间可能存在骨保护素/内皮型一氧化氮合酶/一氧化氮信号通路。     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

糖皮质激素诱发骨丢失的机制

背景糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是目前治疗自身免疫性、结缔组织性疾病的主要方法之一,但治疗后部分患者常发生骨坏死,对其病理机制的深入研究对该病的预防很有必要.目的探讨糖皮质激素诱发骨丢失的机制.设计随机对照实验研究.地点和对象实验在解放军总医院骨科完成,研究对象为成年新西兰白兔31只,雌雄不限,体质量3.0～4.0kg,购于解放军总医院实验动物中心.本院确诊为激素性骨坏死并行髓芯减压或全髋关节置换术患者的病理标本21例,年龄(48.30±6.09)岁.干预①复制Yamamoto氏骨坏死模型,通过病理学、骨丢失检测和免疫组化染色观察骨保护素(OPG)/破骨细胞生成抑制因子(OCIF)表达改变与破骨细胞分化、骨丢失的关系.②收集激素性骨坏死患者的病理标本21例,以无骨代谢疾病患者的股骨标本为对照,免疫组化染色了解激素性骨坏死股骨头局部OPG/OCIF蛋白的表达改变.主要观察指标各实验组骨密度,激素性骨坏死股骨头局部OPG/OCIF蛋白的表达.结果糖皮质激素给药后,继发于OPG表达减低(P＜001)和破骨细胞异常增生后,局部出现渐进性骨丢失(P＜0.05);与正常对照比较,激素性骨坏死患者的股骨头局部OPG表达明显减低(P＜0.05).结论动物模型和临床资料均表明糖皮质激素抑制骨骼局部的OPG表达,使破骨细胞异常增殖,从而出现骨丢失.     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.     

姜黄素调控大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:姜黄素能明显降低破骨细胞的骨重吸收,诱导破骨细胞凋亡,抑制破骨细胞形成。目的:观察不同浓度姜黄素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代后采用成骨培养基进行成骨诱导,在诱导前3d于诱导培养基中分别加入0(对照),10,15μmol/L姜黄素。结果与结论:接种培养7d,倒置显微镜下可见分散的骨髓间充质干细胞小集落,集落细胞呈放射状生长。随培养时间延长,细胞集落增大,细胞形态为长梭形。加入成骨培养基7d后细胞形态逐渐由长梭形变为多角形,随成骨诱导时间延长形态变化更加明显。加入不同浓度姜黄素后骨髓间充质干细胞增殖无变化。姜黄素呈剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性及Runx-2、血红素单加氧酶1的表达。提示姜黄素能有效促进大鼠骨髓间充质干细胞早期成骨分化,其机制可能与提高干细胞血红素单加氧酶1的表达有关。     

脂联素对成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体表达的影响

背景:在骨组织中,护骨素的主要作用是抑制破骨细胞的形成和活性,核转录因子κB受体活化素配体的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性,抑制破骨细胞的凋亡.护骨素/核转录因子κB受体活化素配体在破骨功能调控中起重要作用.近来研究发现脂联素促进成骨细胞增殖和分化,脂联素与骨代谢相互偶联.但脂联素对破骨细胞的作用不明.目的:观察脂联素对成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体和护骨素表达的影响,进一步分析其对破骨细胞生成的作用.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-0612008-12在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成.材料:外科手术取正常成人髂前上棘松质骨用于细胞培养,临床标本由湘雅医院提供.方法:分别用0,3,10和30 mg/L脂联素干预人成骨细胞48 h,检测护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.并用脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统,观察其对破骨细胞生成的影响.主要观察指标:分别采用荧光定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附法检测人成骨细胞护骨素和核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白表达.抗酒石酸磷酸酶染色确定为破骨细胞.结果:脂联素呈剂量依赖性抑制人成骨细胞护骨素mRNA与蛋白质的表达(P<0.05).脂联素呈剂量依赖性促进人成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体mRNA与蛋白的表达(P<0.05).脂联素干预成骨细胞与外周血单核细胞共同培养系统可诱导破骨细胞生成.结论:脂联素可通过诱导成骨细胞核转录因子κB受体活化素配体表达、抑制护骨素表达,诱导破骨细胞生成.     

Notch分子与其配体在32D细胞分化过程中的作用

目的 探讨Notch信号传导系统的作用机制及其对造血系统的影响。方法 将报告基因TP1瞬时转染Notch－CHO和Notch2－CHO细胞后，分别加入转染有不同Notch配体Deltal,Delta4,Jagged1,Jagged2的CHO细胞及正常未转染的CHO细胞，使Notch分子与其配体充分结合并发挥作用，加入发光底物PGL－100，用Lumat测定发光情况。将Notch1－32D细胞加入含G－CSF培养液的CHO，Jagged2-CHO及Delta4-CHO细胞中，观察Notch1－32D细胞分化及分化抑制情况。结果 5种Notch配体与Notch1结合后均能引起荧光素酶活性增高，Jagged2-CHO,Delta4-CHO1-4,Delta4-CHO1-5尤为明显。对Notch2来讲，5种配体均可引起TP1活性的增高。在G－CSF存在下，Notch1－32D细胞可分化为成熟的粒细胞；通过分化抑制实验发现Jagged2能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化，但Delta4不能抑制GCSF引起的Notch1－32D细胞分化。Jadded2,Delta4为Notch1分子的配体，Delta4不能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化，但Jagged2能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.     

微囊化转心房肽基因细胞分泌心房肽近日节律的体外研究

目的 研究人心房肽 (hANP) cDNA转染细胞的微囊化技术中心房肽分泌的近日节律;通过人工调控,改变心房肽分泌的近日节律 ,达到有效治疗高血压或心力衰竭的目的. 方法 将人心房肽基因( cDNA)转染入中国仓鼠卵巢细胞( Chinese hamster ovary,CHO),然后将细胞包被在聚己内酯管内形成微囊,并检测转基因 CHO细胞长时间存活情况和分泌的心房肽.检测微囊化转基因细胞分泌心房肽的生物节律,并用褪黑素进行调整. 结果 在培养期间,长度 20 mm,直径 2 mm的聚己内酯管内转染 CHO细胞在 2 mL培养基中 24 h分泌的心房肽水平可达 210.3 ng/L;心房肽的分泌呈近日节律性变化,日间高,而夜间低;近日节律变化的时相是 415,用褪黑素处理,近日节律的时相移至 755. 结论 心房肽 cDNA转染的 CHO细胞包被在聚己内酯管内并能向管外分泌心房肽,将来可能适于植入人体.此项研究为心房肽治疗高血压或心力衰竭提供了一条新途径.     

人Delta-like-1胞外区在CHO细胞的表达纯化及对造血祖细胞的扩增作用

Notch信号通路在调控造血干细胞的增殖分化中具有重要作用。本研究克隆表达人Notch配体Delta-like-1(Dll-1)的胞外区（hDll-1^ext)，并观察其对脐带血造血祖细胞的扩增作用。从人骨髓单个核细胞中提取总RNA，用RT-PCR的方法扩增Delta-like-1基因胞外区，克隆到T载体。测序正确后，亚克隆到pcDNA3.1/Myc-His( )A表达载体。用脂质体转染CHO细胞，G418筛选克隆，Western印迹检测hDll-1^ext。利用免疫磁性分离方法分离脐带血CD34^ 细胞。结果表明，RT-PCR方法检测到脐事业血CD34^ 细胞表达Notch-1受体。在含rhIL-3，rhSCF及rhVEGF的脐带血CD34^ 细胞无血清培养体系中，加入纯化的hDll-1^ext，通过集落培养检测hDll-1^ext对造血祖细胞的扩增作用。含hDll-1^ext组中CFU-Mix和HPP-CFC数量是对照组的1.5倍，结论：重组的hDll-1^ext对原始的造血祖细胞具有扩增作用。     

Alteration of bone cell function by RANKL and OPG in different in vitro models

BACKGROUND: Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) are well-documented potent regulators of osteoclast development. However, their effects in mature bone cells and in organ cultures have not been well studied. It is uncertain whether their activities in different experimental models are comparable. MATERIALS AND METHODS: RANKL and OPG were evaluated for their activities in mouse calvarial organ cultures, mouse bone marrow cultures, isolated rat mature osteoclast assays and rat primary osteoblast cultures. Results In murine calvarial organ culture, both muRANKL (> or = 10 ng mL(-1)) and rRANKL (> or = 100 ng mL(-1)) significantly stimulated (45)Ca release, while OPG (> or = 50 ng mL(-1)) was an inhibitor of bone resorption. Meanwhile, [(3)H]-thymidine incorporation in this assay was also modulated (indicating proliferation increases in the osteoblast lineage of cells) although these peptides had no direct effect on [(3)H]-thymidine incorporation in isolated osteoblast assays. In mouse bone marrow cultures, muRANKL (> or = 1 ng mL(-1)) and rRANKL (> or = 5 ng mL(-1)) significantly stimulated osteoclastogenesis. The number of nuclei per osteoclast was also significantly increased. OPG strongly inhibited this index, with over 90% suppression at 1 ng mL(-1). Both muRANKL (10 ng mL(-1)) and rRANKL (100 ng mL(-1)) stimulated, while OPG (10 ng mL(-1)) inhibited osteoclast activity in isolated mature osteoclast assays. CONCLUSION: The current study demonstrated that bone resorption modulated by RANKL and OPG, in murine calvarial organ culture, leads to changes in osteoblast proliferation, suggesting a feedback mechanism from osteoclasts to osteoblasts. In addition, it was found that RANKL and OPG have more potent effects on osteoclastogenesis than on the activity of mature osteoclasts.     

柚皮甙干预鼠颅顶骨破骨细胞的形成及功能

背景：柚皮甙能诱导骨形态发生蛋白2的基因表达,促进成骨细胞系的增殖和分化。体外细胞实验提示柚皮甙有抑制破骨细胞的形成及抗骨质疏松的作用。目的：建立含有柚皮甙的鼠颅顶骨培养模型,观察不同剂量下柚皮甙对破骨细胞增殖分化的影响。方法：实验选取出生4d的SD乳鼠颅顶骨,在分别含有O,1,10,100mg／L的柚皮甙的培养基中培养,于培养的第1,3,7,10天测定柚皮甙对鼠颅顶骨中破骨细胞标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数及培养基中钙离子浓度的影响。结果与结论：第1天各组间抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数及培养基中钙离子浓度无明显变化,第3,7天各组间抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数随柚皮甙质量浓度增加而减少,而培养基中钙离子浓度变化明显增加,到第10天这种变化趋势最为明显。说明柚皮甙能影响鼠颅顶骨中抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量及其功能,并且这种作用成明显的时间剂量相关性。提示柚皮甙不仅能促进成骨细胞的增殖,同时也能减少破骨细胞的分化或加速其凋亡。     

VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究

背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.     

破骨细胞在多发性骨髓瘤发病中的作用

目的研究多发性骨髓瘤（MM）细胞对破骨细胞（OC）生成及OC对MM细胞生长与存活的相互作用。方法在不同培养体系中行MM细胞与破骨细胞前体共培养，耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定OC的生成；以RT-PCR检测MM细胞对NF-KB受体激活剂配体（RANKL）／护骨素（OPG）的表达及MM细胞系8226细胞、IL-6依赖性MM细胞系XG1细胞对小鼠原代骨髓基质细胞（pBMSC）表达RANKL／OPG的影响；MM细胞与OC共培养后，采用碘化丙锭（PI）染色，以流式细胞术检测OC对MM细胞增殖周期的影响，Annexin V／PI标记检测OC对MM细胞存活的影响。结果8226及XG1细胞均可直接促进破骨细胞前体向TRAP阳性多个核OC分化。8226、XG1及XG7细胞均不表达RANKL及OPG，8226及XG1细胞促进pBMSC对RANKL的表达，抑制OPG的表达。MM细胞促进OC存活，OC明显促进MM细胞增殖，共培养3d后XG1细胞增殖至（3．8±0．1）×10^9／孔，XG7细胞增殖至（3．9±0．1）×10^5／孔，8226细胞增殖至（4．0±0．1）×10^5／孔，共培养7d后XG1细胞增殖至（8．7±0．1）×10^5／孔，XG7细胞增殖至（9．1±0．1）×10^5／孔，8226细胞增殖至（9．0±0．1）×10^5／孔（P〈0．01）。OC抑制去血清培养诱导的MM细胞凋亡，8226、XG1及XG7细胞与OC共培养后Annexin V^-及PI^-细胞分别为57．71％、82．18％、90．92％（P〈0．01），但对地塞米松诱导的MM细胞凋亡并无拮抗作用。结论MM细胞直接和（或）通过破坏RANKL与OPG之间的平衡间接促进破骨细胞前体向OC分化，OC促进MM细胞生长与存活，从而在MM细胞与OC之间形成恶性循环。