异丙酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞表达释放高迁移率族蛋白1的抑制作用

目的 探讨异丙酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAw 264.7表达和释放高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的抑制作用.方法 检测LPS刺激后,传代培养的小鼠RAW 264.7细胞表达分泌HMGB1的时间梯度,确定RAW 264.7细胞表达分泌HMGBl浓度最高的时间点.随后将RAW 264.7细胞分3组接种于6孔板,每组为两孔:即仅加培养液的对照组(control组);加250μg/L LPs的诱导组(LPS组);加250μg/L LPS基础上加50 μmol/L异丙酚的干预组(LPS+异丙酚组).培养至HMGB1表达分泌浓度最高的时间点后,收集细胞及细胞培养上清,用RT-PCR和Westem blot法分别检测各组细胞内HMGB 1 mRNA表达水平和HMGB1蛋白表达水平,用Westem blot法检测细胞培养上清中HMGB1含量的变化.结果 LPS刺激RAW 264.7细胞后16 h,HMGB1表达达到高峰,随后有所下降;加入异丙酚干预后,细胞HMGB1表达及释放显著低于LPS刺激组(P<0.05);LPS刺激RAW 264.7细胞后16 h,HMCB1 mRNA表达水平明显增强,而加入异丙酚干预后,则明显抑制HMGB1 mRNA表达水平.各组细胞中HMCB1蛋白含量变化和mRNA水平变化一致.结论 异丙酚抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGBl,可能对LPS血症具有一定保护作用.     

NF-κB信号通路在异丙酚抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶基因表达上调中的作用

目的 探讨NF-κB信号通路在异丙酚抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶( iNOS)基因表达上调中的作用.方法 体外培养RAW264.7细胞,以5×105/ml密度接种于6 cm培养皿(3 ml/皿)或6孔板(2 ml/孔),采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=18):正常对照组(C组)、LPS组(L组)和LPS+异丙酚(LP组).C组不做任何处理;L组和LP组均加入1μg/mlLPS,LP组于加入LPS前2h加入50 μmol/L异丙酚.于LPS孵育30 min时,每组取6皿和6孔,收集细胞,分别采用免疫印迹法测定磷酸化IκB激酶(p-IKK)和NF-κB活性;于LPS孵育6h时,每组取6皿,收集细胞,测定iNOS mRNA表达.结果 与C组比较,L组p-IKK和iNOS mRNA表达上调,NF-κB活性升高(P＜0.05);与L组比较,LP组p-IKK和iNOS mRNA表达下调,NF-κB活性降低(P＜0.05).结论 NF-κB信号通路参与了异丙酚抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞iNOS基因表达上调.     

异丙酚对LPS诱导BV-2小胶质细胞IL-1β和TNF-α释放的影响及TLR4在其中的作用

目的 评价异丙酚对LPS诱导BV-2小胶质细胞IL-1β和TNF-α释放的影响及Toll样受体4(TLR4)在其中的作用.方法 将体外培养的BV-2小胶质细胞接种于96孔培养板中,采用随机数字表法,将其随机分为4(n=12):对照组、LPS组、异丙酚组和LPS+异丙酚组.LPS组加入LPS1μg/ml孵育24h;异丙酚组加入异丙酚30 μmol/L孵育24 h;LPS+异丙酚组同时加入LPS 1 μg/ml和异丙酚30 μmol/L孵育24h.于孵育6h时,采用ELISA法检测细胞上清液TNF-α浓度,以此反映TNF-α的释放量,采用RT-PCR法测定TLR4 mRNA表达;于孵育24h时,采用ELISA法检测细胞上清液IL-1β浓度,以此反映IL-1β的释放量,采用Western Blot法检测TLR4蛋白表达.结果 与C组比较,LPS组和LPS+异丙酚组IL-1β和TNF-α的释放量升高,TLR4 mRNA及其蛋白表达上调(P＜0.05);与LPS组比较,LPS+异丙酚组IL-1β和TNF-α的释放量降低,TLR4 mRNA及其蛋白表达下调(P＜0.05).结论 异丙酚可抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞IL-1β和TNF-α的释放,其机制与抑制TLR4的表达有关.     

肝脏Toll样受体4的激活与小鼠肝脏部分缺血再灌注损伤的关系

目的探讨TOLL样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)的激活与肝缺血再灌注损伤的关系.方法以BALB/c小鼠复制肝脏部分缺血再灌注损伤模型,采用免疫组织化学法观察TLR4在肝脏的分布和表达量,同时监测血浆丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)及门静脉血清内毒素(endotoxin,EN)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的变化;再以TLR4先天性缺损小鼠C3H/Hej和野生型鼠C3H/Heouj为模型,观察ALT和门静脉血清TNF-α的变化.结果 1. BALB/c小鼠肝脏左中叶缺血1 h后,再灌注1、3 h,缺血肝叶内TLR4表达增加,且再灌注1 h最强,阳性细胞主要是枯否细胞及血管内中性粒细胞;2.门静脉血清EN在各时间点与假手术组相比无显著差异(P>0.05);3.再灌注3 h,TNF-α较假手术组升高[Hej(152±43)pg/ml vs. (18±10)pg/ml,n=6,t=5.26,P<0.01;Heouj(249±52)pg/ml vs. (25±13)pg/ml,n=6,t=7.24,P<0.01];4. Hej组小鼠肝功能损伤轻于Heouj组小鼠[再灌注1 h(662±106)pg/ml vs. (1 216±174)pg/ml,n=6,t=4.21,P<0.01;再灌注3 h(1 145±132)pg/ml vs. (2 958±187)pg/ml,n=6,t=13.72, P<0.01],且再灌注3 h其血清TNF-α水平明显低于Heouj组小鼠[(152±43)pg/ml vs. (249±52)pg/ml,n=6,t=3.94,P<0.01].结论 TLR4受体在肝脏缺血再灌注损伤过程中被激活,通过TNF-α等细胞因子介导参与了肝脏缺血再灌注损伤的过程.     

异丙酚对LPS诱导中性粒细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素(LPS)诱导中性粒细胞Toll样受体2(TLR2)和TLR4表达的影响.方法 健康志愿者6名,年龄20～35岁,各采集外周静脉血样50 ml,加入20 U/ml肝素抗凝,分离提纯中性粒细胞,制备细胞悬液,然后随机分为6组,每组6皿:对照组(C组)不给予任何药物,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养12 h;异丙酚脂质溶剂intralipid组(I组)、异丙酚组(P组)和LPS组(L组):分别加入intralipid(终浓度为5 μg/ml)、异丙酚(终浓度为5 μg/ml)或LPS(终浓度为1μg/ml),置于37℃、5%CO_2培养箱中孵育12 h;intralipid+LPS组(IL组)和异丙酚+LPS组(PL组)先分别加入intralipid(终浓度为5 μg/ml)或异丙酚(终浓度为5 μg/ml)后,置于37℃、5%CO_2培养箱中孵育20 min,然后加入LPS(终浓度为1μg/ml),置于37℃、5%CO_2培养箱孵育12 h.采用流式细胞仪测定中性粒细胞膜TLR2和TLR4的表达;采用荧光定量PGR检测中性粒细胞膜TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达;采用ELISA法测定培养上清液TNF-α和IL-8的浓度.结果 与C组比较,I组和P组TLB2和TLR4的表达、1NF-α和IL-8L-8的浓度差异无统计学意义(P>0.05),L组和IL组TLR2和TLR4的表达上调,L组TNF-α和IL-8L-8的浓度升高,IL组IL-8浓度升高(P<0.05);与L组比较,IL组TLR2和TLR4的表达、TNF-α和IL-8L-8的浓度差异无统计学意义(P>0.05),PL组TLR2和TLR4的表达下调,TNF-α和IL-8L-8的浓度降低(P<0.05).各组TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚可下调LPS诱导的中性粒细胞TLR2和TLR4的表达,从而抑制炎性反应.     

脂氧素A4对脂多糖活化小鼠巨噬细胞NF-κB和TNF-α转化酶的影响

目的 研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）活化的小鼠巨噬细胞NF-κB及TNF-α转化酶的影响。方法 小鼠RAW 264．7巨噬细胞株培养于细胞培养板,随机分为空白对照组、LPS处理组（LPS 1μg/ml）和LPS＋LXA4组（LPS 1μg/ml＋LXA4 10^-7mol/L）。酶联免疫吸附法测定上清液TNF-α水平,提取细胞总蛋白,Western blot法测定NF-κB p65、IκB-α及TNF-α转化酶含量,荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。结果 LXA4抑制LPS活化的RAW 264．7巨噬细胞IκB-α降解、NF-κB p65核转位及NF-κB活性,同时抑制TNF-α蛋白表达和上调TNF-α转化酶蛋白表达。结论 LXA4通过抑制NF-κB活性和下调TNF-α转化酶表达而减少LPS活化的RAW264．7巨噬细胞分泌TNF-α。     

异丙酚对内毒素诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞P2X7受活化和IL-1β蛋白合成的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞P2X7受体活化和IL-1β蛋白合成的影响.方法 RAW264.7巨噬细胞经1 μmol/L亮蓝G(BBG)或1～100 μmol/L异丙酚孵育20 min,随后经1 μg/ml LPS孵育4 h,采用ELISA法测定IL-1β的释放量,采用Western blot法测定胞内IL-1β前体蛋白和成熟体蛋白含量,并计算异丙酚抑制IL-1β释放的半数有效浓度(IC_(50)).采用全细胞膜片钳记录模式,RAW264.7巨噬细胞经1 mmol/L ATP孵育5s,以诱发P2X7受体门控离子通道电流,分别经1～1 000μmol/L异丙酚孵育4 min后记录电流峰值,计算异丙酚抑制P2X7受体门控离子通道电流峰值的IC_(50).结果 异丙酚可抑制LPS诱导的IL-1β的释放,其IC_(50)为(24±3)μmol/L.异丙酚可抑制P2X7受体门控离子通道电流峰值,其IC_(50)为(33±5)μmol/L.LPS可上调胞内IL-1β前体蛋白表达(P<0.01),而3～100μmol/L异丙酚可抑制LPS介导的胞内IL-1β前体蛋白表达上调.结论 异丙酚抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞IL-1β的释放可能与抑制P2X7受体的活化和胞内IL-1β前体蛋白的合成有关.     

氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达影响的实验研究

目的探索氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达的影响。方法取MC3T3-E1细胞系及RAW264.7细胞系,分别培养传至第7代进行实验。利用不同浓度(0、25、50、100μmol/L)H_2O_2刺激RAW264.7细胞,MTS检测培养1、3、6 h后细胞增殖率,采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒检测培养1 h时细胞内SOD含量,筛选H2O2引起RAW264.7细胞氧化应激的最佳浓度和作用时间,并对应收集RAW264.7细胞(加或不加H_2O_2处理)24 h上清液。取第7代MC3T3-E1细胞,分别以100μL无血清DMEM培养基(A组)、未氧化应激RAW264.7细胞上清液(B组)、氧化应激RAW264.7细胞上清液(C组)培养,采用MTS法检测细胞增殖情况,行划痕实验检测细胞迁移能力;另取细胞分为4组,空白对照组,以完全培养基培养;阳性对照组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基进行成骨诱导培养;正常对照组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及未氧化应激RAW264.7细胞上清液培养;实验组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及氧化应激RAW264.7细胞上清液培养。培养3、7、14 d,RT-PCR检测细胞内成骨相关基因ALP、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)表达水平。结果 MTS和SOD检测结果显示:25μmol/L H_2O_2刺激1 h为构建RAW264.7细胞氧化应激模型最佳浓度和作用时间。细胞生长检测显示:1、2、3 d B、C组细胞增殖率显著高于A组(P0.05),C组低于B组,其中2、3 d时组间比较差异有统计学意义(P0.05)。划痕实验显示12 h时B、C组MC3T3-E1细胞迁移显著快于A组,C组快于B组,细胞迁移距离比较差异有统计学意义(P0.05);24 h时B、C组划痕已被细胞爬满。除3 d外,实验组各时间点ALP、Runx2、OC、BSP m RNA相对表达量均较阳性对照组明显降低,OPN、COL-Ⅰm RNA相对表达量较空白对照组降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 H_2O_2构建RAW264.7细胞氧化应激模型的最佳浓度为25μmol/L、作用时间为1 h。氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞上清液能促进MC3T3-E1成骨细胞迁移、抑制其增殖及成骨相关基因的表达。     

异丙酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞表达释放高迁移率族蛋白1的抑制作用

Objective To explore the inhibition effect of propofol on HMGB1 expression and releasing from mouse macrophage cell RAW264.7 induced by LPS. Methods Detect the time course of HMGB1 expression of RAW264.7 cells using RT-PCR and western blot. Then cells were divided into three groups: control, 250μg/L LPS stimulated, 250μg/L LPS stimulated simultaneously with 50μmol/L propofol. HMGB1 expression and releasing were detected using RT-PCR and western blot when cell were stimulated until the time the HMGB1 expression got to the highest level. Results 16 h after stimulated by LPS, the HMGB1 expression got to the highest level. When LPS stimulated with 50μmol/L propofol, the expression and releasing of HMGB1 by RAW264.7 were inhibited (P<0.05);16 h after stimulated by LPS, the HMGB1 mRNA expression got to the highest level,When LPS stimulated with 50μmol/L propofol, the expression and releasing of HMGB1 mRNA by RAW264.7 were inhibited Significantly,in each group ,the changes of HMGB1 Protein are the same to that of HMGB1 mRNA. Conclusion Propofol can inhibit the expression and releasing of HMGB1 by RAW264.7, which may be play a role in protect of sepsis by LPS.     

异丙酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞表达释放高迁移率族蛋白1的抑制作用

Objective To explore the inhibition effect of propofol on HMGB1 expression and releasing from mouse macrophage cell RAW264.7 induced by LPS. Methods Detect the time course of HMGB1 expression of RAW264.7 cells using RT-PCR and western blot. Then cells were divided into three groups: control, 250μg/L LPS stimulated, 250μg/L LPS stimulated simultaneously with 50μmol/L propofol. HMGB1 expression and releasing were detected using RT-PCR and western blot when cell were stimulated until the time the HMGB1 expression got to the highest level. Results 16 h after stimulated by LPS, the HMGB1 expression got to the highest level. When LPS stimulated with 50μmol/L propofol, the expression and releasing of HMGB1 by RAW264.7 were inhibited (P<0.05);16 h after stimulated by LPS, the HMGB1 mRNA expression got to the highest level,When LPS stimulated with 50μmol/L propofol, the expression and releasing of HMGB1 mRNA by RAW264.7 were inhibited Significantly,in each group ,the changes of HMGB1 Protein are the same to that of HMGB1 mRNA. Conclusion Propofol can inhibit the expression and releasing of HMGB1 by RAW264.7, which may be play a role in protect of sepsis by LPS.