苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾通道的影响

目的 :研究苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾 [K(Ca) ]通道的影响。方法 :应用膜片钳单通道技术记录苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元上K(Ca)通道电流活动。电流信号经放大、滤波及转换后输入微机进行采样、储存和分析。结果 :苯妥英对缺氧大脑皮质神经元K(Ca)通道具有明显的激活作用 ,主要是增加通道的开放概率 (openprobability,Po)。结论 :苯妥英激活大脑皮质神经元K(Ca)通道 ,产生超极化电位 ,从而稳定细胞膜 ,降低细胞兴奋性 ,延缓缺氧除极的发生 ,这可能是苯妥英抗缺血脑损伤的另一个重要机制     

亚低温3 h可抑制新生大鼠缺氧缺血性脑细胞凋亡的影响

实验建立缺氧缺血性脑损伤新生大鼠模型,于缺血缺氧后立即采用31 ℃亚低温分别持续3,6,15 h进行全身干预,原位末端标记技术标记显示大鼠大脑皮质、海马、室周白质的凋亡细胞数减少,免疫组织化学法检测的细胞凋亡相关蛋白bcl-2和细胞周期调节相关蛋白p16表达降低,综合比较全部结果数据显示,且以亚低温干预3 h细胞凋亡抑制效果最佳,其次是亚低温干预6 h,而亚低温干预15 h可出现大脑皮质神经元细胞数降低的不良反应。结果证实,31 ℃亚低温干预可通过抑制细胞凋亡的方式对缺氧缺血性脑损伤组织起保护作用,3 h为最佳干预时间。     

亚低温对星形胶质细胞缺氧后缝隙连接功能的影响

目的观察亚低温对缺氧条件下星形胶质细胞缝隙连接变化的影响,探讨亚低温对脑缺血的保护机制。方法原代培养星形胶质细胞,传至第3代以神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定星形胶质细胞,采用三气培养箱分别调节温度,缺氧12 h。分为正常对照组(对照组)、常温(37.0 oC)缺氧组、亚低温(32.0 oC)缺氧组。用锥虫蓝染色法测定各组缺氧后星形胶质细胞存活率;应用划痕标记染料示踪技术在激光扫描共聚焦显微镜下测定缺氧12 h荧光黄染料在缝隙连接间的扩散距离;细胞免疫荧光技术检验缺氧星形胶质细胞缝隙连接的主要缝隙连接蛋白成分Cx43表达水平。结果常温缺氧组部分细胞边缘皱缩;亚低温缺氧组经亚低温干预后大部分细胞轮廓较清晰,胞周光晕明显,细胞存活力较常温缺氧组增加;对照组、常温缺氧组及亚低温缺氧组死亡细胞数分别为(6.19±0.29)个、(8.54±0.99)个和(6.89±2.41)个,对照组死亡细胞数最少,组间两两比较均差异有统计学意义(P0.05);常温缺氧组荧光黄染料仍可在细胞间进行扩散,扩散距离和Cx43荧光强度较对照组无明显变化(P0.05);亚低温缺氧组与对照组和常温缺氧组比较,荧光染料扩散距离减少、Cx43荧光强度降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论亚低温可以减轻体外培养星形胶质细胞的缺氧损伤;降低Cx43表达而抑制缝隙连接功能,可能是亚低温干预的脑保护机制之一。     

大鼠脑干前庭核团向大脑前庭皮层的投射研究

目的观察Wistar大鼠脑干前庭核团是否存在直接向大脑皮质的纤维投射。方法健康Wistar大鼠20只,随机分为实验组(10只)和对照组(10只)。实验组脑干前庭内、外侧核团注射绿色荧光标记的顺行示踪剂刀豆凝集素,对照组脑干前庭内、外侧核团注射生理盐水。5d后处死大鼠,行大脑连续冰冻切片,荧光显微镜下观察荧光细胞在大脑皮质的分布及形态。结果绿色荧光标记的神经元主要位于大脑皮质的前肢感觉区、后肢感觉区和本体感觉区。结论 Wistar大鼠脑干前庭核团存在直接向大脑皮质的纤维投射,部分和本体感觉区相重叠。     

缺血缺氧对体外培养星形胶质细胞细胞周期和增殖的影响

目的 观察缺血缺氧损伤对星形胶质细胞细胞周期和增殖的影响。方法 用流式细胞仪检测缺血缺氧后不同时问点星形胶质细胞细胞周期变化，并用荧光免疫细胞化学技术测定胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。结果 体外缺血缺氧损伤后星形胶质细胞S期较正常组明显增高，6h达高峰，而随后则呈下降趋势。PCNA阳性反应损伤后表达均增加，6h表达最高；在缺血缺氧早期，GFAP阳性染色增强，6h最高；缺血缺氧12h后GFAP阳性染色变弱。结论 缺血缺氧损伤后星形胶质细胞活化进入增殖期；PCNA参与了损伤后星形胶质细胞的修复和增殖；细胞周期事件与星形胶质细胞的活化密切相关。     

槲皮素对缺血缺氧损伤星形胶质细胞基因表达的影响

目的 应用高密度寡核苷酸(Oligo)基因芯片技术研究槲皮素对缺血缺氧损伤的星形胶质细胞基因表达的影响.方法 体外原代培养星形胶质细胞分为缺血缺氧组和缺血缺氧+槲皮素处理组.2组细胞厌氧培养4h后缺血缺氧+槲皮素处理组加入含50 μmol/L槲皮素的培养液,缺血缺氧组加入等量培养液,培养24 h后应用基因表达谱芯片筛选2组细胞表达差异的基因并用实时荧光定量PCR检测进行验证.结果 基因表达谱芯片分析显示缺血缺氧+槲皮素处理组与缺血缺氧组比较表达差异的基因共180个,其中上调基因49个,下调基因131个;实时荧光定量PCR结果 显示缺血缺氧+槲皮素处理组细胞与缺血缺氧组比较148个基因的表达发生变化,差异均有统计学意义(P＜0.05),其中上调基因34个,下调基因114个.实时荧光定量PCR与基因表达谱芯片结果 的符合率为82.2％(148/180).结论 基因表达谱芯片分析有助于从分子水平全面了解槲皮素对缺血缺氧的星形胶质细胞的作用机制,也为进一步研究槲皮素和星形胶质细胞在缺血缺氧脑损伤中的作用奠定了基础.     

一氧化氮在缺氧复氧性神经元凋亡中的作用

目的观察神经元缺氧复氧损伤时NO的动态变化及其与神经元凋亡的关系。方法取孕13~15d ICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮质神经元进行原代分离培养,建立缺氧复氧诱导的皮质神经元凋亡模型。用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用MTT测定细胞活性,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果经缺氧复氧处理的神经元,随着缺氧时间延长细胞存活率逐渐下降,神经元凋亡率呈时间依赖性升高,NO含量逐渐升高,至缺氧8h复氧24h达到高峰,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。细胞超微结构呈现凋亡样改变。结论NO介导了缺氧复氧性神经元凋亡过程。     

醒脑静对缺氧神经元凋亡的影响研究

目的观察醒脑静对缺氧神经元凋亡的影响。方法利用原代培养的SD大鼠大脑皮质神经元缺氧模型,通过An-nexin V、Hoechest33258染色半定量测定10μg/ml和1.0μg/ml浓度的醒脑静对缺氧神经元凋亡的影响。结果10μg/ml的醒脑静有显著降低缺氧神经元凋亡的作用,但较小剂量醒脑静则无此作用。结论醒脑静对培养大鼠大脑皮质神经元具有保护作用。     

人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化

背景：研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活，并减轻缺氧缺血性脑损伤程度，显著改善脑损伤大鼠的远期行为学，但作用机制仍未阐明。 目的：将人脐血单个核细胞经侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内，观察植入细胞在脑内的迁移与分化。 设计、时间及地点：细胞学体内观察，于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成。 材料：脐血来源于健康、足月妊娠产妇，由潍坊医学院附属医院产科提供。清洁级健康7 d龄SD新生大鼠50只，由山东省中医药大学动物中心提供。 方法：Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞，移植前3 d行BrdU标记。50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型，造模后24 h，在左侧侧脑室(AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm)注入脐血单个核细胞悬液，2 μL/点，共1×105个活细胞。分别于细胞移植后24 h，3 d，7 d，14 d，28 d取材制备脑组织切片，10只/时间点。 主要观察指标：采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况。 结果：50只大鼠均进入结果分析。①移植后24 h侧脑室内可见BrdU+细胞；移植后3，7 d移植细胞迁移到室管膜下区；移植后14，28 d移植细胞迁移到大脑皮质及海马。②移植后24 h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞；移植后3 d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞；移植后7 d BrdU+nestin+细胞数增加；移植后14 d BrdU+nestin+细胞数下降。③移植后14 d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞，移植后28 d双阳性细胞数进一步增加，BrdU+NSE+ 细胞及BrdU+ GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加。 结论：脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活，并迁移到大脑皮质与海马部位，分化为成熟的神经元与神经胶质细胞。     

缺血缺氧对体外培养星形胶质细胞细胞周期和周期相关蛋白的影响

目的 观察缺血缺氧损伤对星形胶质细胞细胞周期及细胞周期相关蛋白的影响。方法 用流式细胞仪及Brdu掺入法检测缺血缺氧后不同时间点星形胶质细胞细胞周期变化和细胞的增殖活力；用荧光免疫细胞化学技术测定增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平。结果 体外缺血缺氧损伤后S期星形胶质细胞较正常组明显增加，6h达高峰，Brdu掺入法显示损伤后6h星形胶质细胞的增殖活力最高，而随后S期细胞数目及细胞增殖活力都呈下降趋势。PCNA阳性反应损伤后表达增加，6h表达最高，而cyclin D1的表达在损伤后逐渐增加，在24h时达高峰。结论 缺血缺氧损伤激活星形胶质细胞，使其进入新的细胞周期，出现细胞的增殖反应；PCNA及cyclin D1参与了损伤后星形胶质细胞的修复和增殖；细胞周期事件与星形胶质细胞的增殖活化密切相关。     

凋亡敏感基因在短暂性缺氧再复氧复注血清后的大鼠星形胶质细胞中的表达及其意义

目的研究一种新发现的抗氧化蛋白质--凋亡敏感基因(SAG)在短暂性缺氧再复氧复注血清诱导的细胞坏死和凋亡中的作用.方法用短暂性缺氧再复氧复注血清来诱导原代培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞损伤,用免疫细胞化学方法检测凋亡敏感基因的表达,并作图像分析;用流式细胞仪检测胶质细胞在短暂缺氧再复氧复注血清后不同时间点的凋亡率.结果凋亡敏感基因在缺氧15 min再复氧复注血清5 h后表达最高,在复氧复注血清16 h后恢复至对照组水平;细胞凋亡率在缺氧15 min再复氧复注血清1h时达到最高,而在再复氧复注血清5 h后降至对照组水平.结论凋亡敏感基因具有抗凋亡的作用,可减轻星形胶质细胞的缺血再灌注损伤.     

ephrinA3在脂多糖诱导的星形胶质细胞中的表达变化

目的 探讨ephrinA3在脂多糖诱导的大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的表达变化.方法 提取新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞并纯化培养,随机分为对照组和实验组,脂多糖10mg/L干预后,实验组又分为30min组、6h组、24h组、48h组和72h组,采用倒置相差显微镜观察星形胶质细胞形态学变化,MTT法检测细胞活力,AO/EB荧光染色检测细胞凋亡和坏死情况,CY3免疫荧光及Western blot方法测定不同时间点ephrinA3的表达变化.结果 在脂多糖作用的不同时间中,与对照组相比,作用24h、48h、72h的细胞存活率显著升高,凋亡率显著下降,ephrinA3表达显著升高.结论 ephrinA3在脂多糖诱导的大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的表达增高,持续至少72h,其在中枢神经系统损伤后星形胶质细胞增殖方面起重要调控作用.     

大黄酚对神经细胞缺氧损伤的保护作用

目的 观察大黄酚对缺氧PC12细胞损伤的保护作用;方法 培养PC12细胞,建立缺氧致神经细胞损伤模型;缺氧前后四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测PC12细胞增殖活性、光镜观察PC12细胞形态、测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、早期癌基因表达产物（c-fos）荧光免疫组化表达和逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）分析神经型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达;结果 大黄酚明显改善缺氧PC12细胞的活力,对损伤细胞形态有改善作用,使损伤细胞的培养上清液中的LDH明显减少;c-fos表达减少,PCR结果分析显示nNOS mRNA在缺氧早期表达.iNOSmRNA主要在缺氧晚期表达.结论 本缺氧模型能够引起PC12细胞凋亡现象,大黄酚能减轻PC12细胞缺氧损伤,对神经元细胞有保护作用.     

6-羟基褪黑素保护神经细胞抗缺血再灌注损伤的作用机制

目的探讨6-羟基褪黑素的神经保护作用及作用机理。方法体外培养神经母细胞瘤N2a细胞，缺糖、缺血清和缺氧（OGSD）90min，再正常培养不同时间，同时加入6-羟基褪黑素，观察细胞生存能力（MTT法）、线粒体跨膜电位变化（荧光标记）、线粒体细胞色素C释放（western blot）、caspase3活性（荧光底物）以及细胞内活性氧（荧光标记）的产生。结果6-羟基褪黑素抑制细胞色素C释放，抑制caspase3激活，清除细胞内活性氧，稳定线粒体跨膜电位。结论6-羟基褪黑素通过直接抗氧化作用和抑制线粒体凋亡途径促进神经细胞生存。     

缺氧对海马培养细胞人重组白细胞介素-6免疫组化反应的影响

本文观察了缺氧对体外培养海马细胞中rhIL-6免疫反应的影响。结果显示，体外培养的海马神经元和神经胶质细胞的rhIL-6呈弱阳性免疫反应，缺氧1～4h后神经元和神经胶质细胞的rhIL-6免疫组化反应明显增强。对免疫染色细胞作图像分析结果显示，缺氧后神经元和神经胶质细胞的平均光密度较缺氧前增加，尤以缺氧2h时最明显，之后随缺氧时间延长，神经元和神经胶质细胞的平均光密度又逐渐减弱。上述结果表明，海马脑区存在rhIL-6免疫反应细胞；缺氧条件下rhIL-6免疫组化反应增强，提示rhIL-6可能参与脑缺氧损伤的调控。     

新药介绍

脑复康针剂又称乙酰胺吡咯烷酮注射液,系锦州制药二厂产品。该药为促思维记忆药;具有抗大脑皮质缺氧,活化大脑细胞,增进磷酯吸收与脑蛋白的合成作用,加速脑半球间经由胼胝体的信息传递速度,增加脑血流量,提高颈动、静脉分压差,有利于脑组织对氧的摄取和利用。     

高糖对缺氧神经元的影响及钙相关机制研究

研究高糖对神经元缺氧的影响,并探讨其钙相关机制.利用SD大鼠大脑皮质神经元体外缺氧模型,通过对细胞活力的检测,观察浓度分别为22.7(对照组),30,40,50,60(高糖组)mmol/L的葡萄糖对神经元缺氧的影响;以Fura-2/Am为荧光指示剂,测定细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i.结果发现当培养基中葡萄糖浓度达到60 mmol/L时,高糖可引起缺氧神经元损伤;与对照组相比,有钙介质与无钙介质中静息[Ca2+]i均升高,P＜0.01;但对照组与高糖组在有钙介质中对氯化钾(KCl)、谷氨酸(Glu)刺激引起的[Ca2+]i升高无明显差异,P＞0.05;在无钙介质中,对氯化钙(CaCl2)引起的[Ca2+]i增高率无明显差别,P＞0.05.本研究表明:高糖对神经元的损伤作用可能与其促进细胞内钙离子释放,诱发细胞内钙超载有关.     

锂剂抑制新生鼠缺氧缺血后的细胞凋亡及炎症反应研究

目的探讨锂对新生鼠缺氧缺血后的神经保护作用及相关机制。方法 40只9日龄Wistar雄性大鼠建立缺氧缺血动物模型,术后给予相同剂量的氯化锂或生理盐水干预,缺氧缺血后3d灌注取脑,MAP-2免疫组化染色评估脑损伤体积,Caspase-3检测细胞凋亡,Iba-1,Galectin-3检测神经炎症反应。结果缺氧缺血后3d,锂盐治疗组脑组织脑损伤体积较对照组明显减少(P<0.01);生理盐水组动物大脑皮质Caspases-3阳性细胞数目为(32.5±5.37)个,而锂盐治疗组则为(17.3±4.46)个(P<0.01),锂盐治疗后海马DG区Caspase-3阳性细胞数目仅为对照组的约1/4(P<0.001);Iba1染色,生理盐水组动物皮层及海马DG区Iba1阳性细胞数目分别为112.6±10.72和342.5±9.67,均显著高于锂盐治疗组(皮层72.4±7.33,海马DG区224.6±9.34)(P<0.01,P<0.01);Galectin-3染色,锂盐治疗后,实验动物大脑皮质及海马DG区Galectin-3阳性细胞数目均明显少于生理盐水组(P<0.05,P<0.01)。结论锂对新生鼠缺氧缺血具有显著的神经保护作用,其机制可能为减少细胞凋亡或抑制缺氧缺血后的神经炎症。     

缺氧对原代培养大鼠小胶质细胞生物学功能的影响

目的 通过观察缺氧环境中原代培养大鼠小胶质细胞生物学功能的变化,进一步探讨活化态小胶质细胞在缺血缺氧性脑病中的作用机制.方法 通过建立原代培养的SD大鼠小胶质细胞的缺氧模型,观察细胞形态学及其增殖活力的改变.利用ELSIA检测TNF-α、IL-1β含量改变,利用荧光探针DAF- FMDA检测iNOS的相对活性.结果 在缺氧旱期,原代培养小胶质细胞增殖在缺氧早期开始,增殖活力于缺氧3h时最高,其后随着缺氧时间的延长而降低.在缺氧早期小胶质细胞培养上清液内TNF-α、IL- 1β含量以及iNOS相对活性等多种神经毒性因子的表达水平增加.结论 缺氧可诱使小胶质细胞生物学功能改变,呈现应激活化状态,主要表现在细胞生长增殖活力先上调后下降,神经毒性因子表达水平显著增高等方面.     

缺氧诱导因子1α经多配体蛋白聚糖1调控缺氧胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺抵抗机制初探

目的初步探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与多配体蛋白聚糖1(SDC1)在缺氧胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺(TMZ)化疗抵抗调控中的相互作用。方法将U87细胞分为常氧组、常氧+TMZ组、常氧空载组、常氧空载+DMSO组、常氧空载+TMZ组、常氧SDC1过表达组、常氧SDC1过表达+TMZ组, 缺氧组、缺氧+TMZ组、缺氧空载组、缺氧敲除HIF-1α组、缺氧敲除HIF-1α组+TMZ、缺氧SDC1干扰组、缺氧空载+DMSO组、缺氧空载+TMZ组、缺氧SDC1干扰+TMZ组。采用低氧探针检测细胞缺氧情况;TMZ处理72 h后, 采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡情况;敲除HIF-1α后, 于缺氧条件下培养细胞并给予TMZ处理2 、4 、6 、8 d, 检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放及细胞凋亡。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(WB)法检测细胞HIF-1α、SDC1基因和蛋白质的表达量;采用染色质免疫共沉淀(ChIP)-qPCR(ChIP-qPCR)法检测HIF-1α与SDC1启动子结合情况。分析中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库(32...