合成纳米铝佐剂及其对乙型肝炎、狂犬病毒辅佐效应的研究

目的 通过自制纳米铝佐剂,研究其对乙型肝炎病毒和狂犬病毒的体液免疫应答。方法 在25℃条件下,采用微乳液法制备纳米铝佐剂。与常规铝佐剂比较,经皮下注射豚鼠和Balb／c小鼠后,于不同的时间测定血清中特异性酥;抗体的效价。结果 透射电镜（TEM）和差式量热扫描（DSC）,可知产物为平均粒径约为72．62nm,近球形的A1（OH）3结晶颗粒。纳米铝佐剂辅佐的HBsAg,在免疫Balb／c小鼠后第1周和第2周的血清抗体滴度明显高于常规铝佐剂组（P〈0．01;P〈0．05）;纳米铝佐剂辅佐的狂犬疫苗,其特异性IgG抗体效价高于常规铝佐剂组,并且在免疫后的第7天,抗体就呈现出阳性（P〈0．05）。结论 纳米铝佐剂在诱导HBsAg和Rabies疫苗体液免疫应答的早期优于目前的常规铝佐剂,能够快速地激活和提高Balb／c小鼠和豚鼠的免疫应答和应答水平。     

重组流感血凝素三聚体蛋白疫苗的制备及免疫原性评价

目的制备重组流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)三聚体蛋白疫苗并进行相关表征分析, 研究重组HA三聚体在小鼠模型中的免疫原性。方法构建稳定表达HA三聚体蛋白的CHO细胞株, 通过Western blot、单向免疫扩散试验、蛋白质粒径检测和N-糖基化位点分析对重组蛋白进行定性及定量分析。根据剂量、佐剂等处理条件的不同将BALB/c小鼠分为11个组, 并进行一致的免疫程序。初次免疫后56 d检测血清中和抗体效价, 以评价免疫原性。结果构建的CHO细胞株能够分泌表达HA三聚体。HA三聚体具备生物学活性能够在单向琼脂免疫扩散试验中形成沉淀环, 蛋白质粒径大小约为18.79 nm, 具有10个N-糖基化位点, 包括高甘露糖型、复合糖型和杂合糖型;HA三聚体重组蛋白疫苗在2次免疫小鼠后, 3.75 μg剂量配伍RFH01佐剂与对照组单价疫苗原液15 μg引起的中和抗体效价差异无统计学意义(P=0.431 2, U=36), 配伍佐剂组免疫后血清抗体效价均高于未加佐剂组, 其中15 μg HA三聚体+RFH01组效价最高, 为1 280。结论成功制备了流感病毒重组HA三聚体蛋白, 其...     

新型免疫佐剂在淋巴细胞杂交瘤技术中的应用

目的：观察新型免疫佐剂ImmunEasy^TM(Cp GODN)的免疫调节作用，并与弗氏佐剂相比较，探讨其在单克隆抗体制备中的应用前景。方法：将小鼠用新型免疫佐剂ImmunEasy^TM或弗氏佐剂混合原核表达的重组APRIL抗原，分别以常规免疫和少量抗原免疫方案免疫Balb／c小鼠，用间接ELISA法检测不同时相小鼠免疫血清抗APRIL抗体的总效价及各类和亚类的效价。建立一种能在单个细胞水平反映小鼠B细胞分泌特异性抗体亚类的改良ELISPOT方法，并对两种佐剂免疫组中配对的小鼠进行检测。常规方法制备杂交瘤，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，比较不同佐剂免疫小鼠所获得的杂交瘤上清液的类及其亚类频率。结果：与弗氏佐剂相比，ImmunEasy^TM在单克隆抗体制备过程中可明显减少抗原用量，缩短免疫周期，提高免疫血清效价，并增加IgG2a、IgM及IgA抗体的比例。结论：在细胞融合制备鼠源性mAb中，应用ImmunEasy^TM，可减少免疫原用量，提高效率，还可优先获得某些类及其亚类的mAb。     

人源轮状病毒转基因马铃薯口服免疫小鼠的免疫应答研究

目的分析人源轮状病毒转基因植物抗原的口服免疫应答反应。方法在根癌脓杆菌介导获得系列转基因马铃薯植株的基础上，用ELISA分析转基因马铃薯中目的蛋白表达水平。马铃薯块茎直接口服免疫Balb／c小鼠，ELISA分析免疫小鼠血清、唾液、粪便提取物特异抗体水平。结果获得一株最高表达量的转化株；口服免疫可诱导较强的血清IgG反应和强烈的黏膜sIgA反应，粪便的sIgA最高，唾液次之，尿液中无sIgA；加霍乱毒素B亚单位（CTB）佐剂免疫组小鼠和霍乱毒素（CT）佐剂免疫组小鼠抗体水平无显著差异，无佐剂免疫组小鼠抗体水平略低。结论人源轮状病毒转基因植物疫苗联合黏膜佐剂免疫动物可诱导特异的系统与黏膜免疫应答，且黏膜免疫强度略高于系统免疫。     

基因药物载体重组古菌组蛋白的免疫原性研究

目的 观察基因药物载体重组古菌组蛋白(HphA)在鼠模型中的免疫原性,为开发安全有效的基因药物载体重组古菌组蛋白奠定基础.方法 Balb/c小鼠随机分为重组古菌组蛋白实验组、重组古菌组蛋白佐剂实验组、牛血清白蛋白佐剂对照组,测定免疫小鼠中体液和细胞免疫应答水平.体液免疫应答水平通过采用酶联免疫吸附试验(ELISA)考察测定血清中的抗体水平;细胞免疫应答水平通过测定脾淋巴细胞的增殖指数和其分泌的IFN-γ浓度进行评价.结果 ELISA法未检测出重组古菌组蛋白免疫小鼠血清中产生特异性抗体,淋巴细胞的刺激指数及其分泌IFN-γ浓度与对照组相比无统计学意义(P＞0.05).结论 重组古菌组蛋白免疫在鼠模型中没有免疫原性,不能诱导免疫小鼠产生特异性体液应答和细胞免疫应答.     

幽门螺杆菌感染小鼠及其抗原免疫小鼠后体液免疫应答的比较

目的：比较BALB／c小鼠感染H.pylori后以及经H.pylori UreB抗原口服免疫后的体液免疫应答的差异。方法：80只BALB／c小鼠分为感染组和免疫组，感染组灌喂H.pylori小鼠适应株；免疫组灌喂重组H.pylori UreB抗原和佐剂LTB。在试验的0，2，6和10周时每组分别取10只小鼠收集唾液及血液标本，用ELISA法检测抗UreBIgG和IgA抗体，同时采集胃组织作H.pylori感染检测。结果：感染组小鼠在灌喂H.pylori后2，6，10周，感染率均为100％，其血清中抗UreB IgG增高明显，但血清及唾液中均未见IgA的明显升高，；免疫组小鼠在初次免疫后第6，10周后，血清及唾液中抗UreB,IgG和IgA抗体的均显著升高。结论：H.yplori感染BALB／ c小鼠不能诱导其产生明显的特异性黏膜免疫应答，而重组UreB可作为良好的免疫原诱导其产生分泌型IgA抗体。     

不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫效果的研究

目的 研究不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫Balb/c小鼠,观察机体产生体液免疫和局部粘膜免疫反应的效果,为发展黏膜疫苗提供理论基础.方法 鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原按比例分别与PorB(2类外膜蛋白)重组蛋白、蛋白体佐剂制备黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,取尾静脉血,采用ELISA检测血清IgG及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液sIsA;采用FAC检测脾淋巴细胞表型的变化.结果 PorB重组蛋白佐剂疫苗组和蛋白体佐剂疫苗组较无佐剂组体液免疫抗体水平高、蛋白体佐剂疫苗组好于PorB重组蛋白佐剂疫苗组,但无显著性差异.结论 PorB重组蛋白佐剂疫苗和蛋白体佐剂疫苗均能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫应答,且PorB重组蛋白佐剂疫苗免疫效果可与蛋白体佐剂疫苗相媲美,可进一步论证是否可用PorB重组蛋白佐剂替代蛋白体佐剂,这为鼠疫粘膜疫苗的研制奠定了基础.     

同基因背景小鼠核蛋白诱导狼疮鼠模型

背景：自发性狼疮鼠模型不能对基因以外其他的致病因素进行研究。 目的：以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫小鼠后诱导狼疮鼠模型。 方法：选取4~6周SPF级Balb/c小鼠30只,等分为3组。V1组肌肉注射提取的同系Balb/c小鼠核蛋白,间隔3周免疫1次,共免疫4次;V2组注射等体积PBS;V3组为正常对照。检测小鼠末次免疫后3周的24 h尿蛋白、血清抗核抗体、抗双链DNA抗体、小鼠肾脏直接免疫荧光。 结果与结论：V1组小鼠24 h尿蛋白、血清抗双链DNA抗体、抗核抗体均明显高于V2组、V3组,且V1组小鼠肾小球有免疫球蛋白G免疫复合物沉积,可见肾小球轮廓,V2组、V3组未见肾小球轮廓,只见非特异性的微弱荧光。说明以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫Balb/c小鼠能够成功诱导狼疮鼠模型。     

重组戊型肝炎氢氧化铝佐剂疫苗的磷含量与免疫效力关系研究

目的探索氢氧化铝佐剂戊肝疫苗的免疫原性与疫苗中PO_4~(3-)浓度的关系,并分析抗体滴度与抗原在羊淋巴液中吸附率有无相关性。方法用不同浓度PO_4~(3-)处理氢氧化铝佐剂制备试验疫苗,腹腔免疫Balb/c小鼠,ELISA法定量检测免疫后不同时间血清抗体滴度,同时采用钼酸铵还原法检测试验疫苗离心沉淀中的磷含量,根据兰格缪尔方程计算抗原在含不同浓度PO_4~(3-)的佐剂表面的最大吸附量(Γm)。试验疫苗在羊淋巴液中的抗原吸附率采用ELISA法检测。结果随疫苗中PO_4~(3-)浓度增加,抗原最大吸附量(Γm)减小,抗原在羊淋巴液中的吸附率下降,免疫血清抗体滴度渐次增加,直至达到平稳状态。结论在一定范围内增加疫苗磷酸根含量可减小抗原在羊淋巴液中吸附率,降低佐剂对抗原的吸附程度,提高疫苗免疫抗体滴度。     

单磷酸脂质A佐剂对无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果研究

目的 探讨单磷酸脂质A(MPLA)佐剂对无细胞百日咳疫苗(aP)的免疫保护效果影响.方法 aP中添加MPLA佐剂,在Balb/c小鼠上进行免疫以及感染保护实验.通过检测小鼠百日咳特异性IgG抗体及其分型抗体IgG1和IgG2a水平、感染后白细胞变化以及气管和肺组织细菌定植来进行免疫效果的评估.结果 aP+MPLA免疫的...     

五株EV71病毒毒力、免疫原性与基因组比较分析

目的对5株EV71分离株(LCH01、LCH02、BJ01、BJ02、AH01)进行毒力、免疫原性和基因组的比较分析。方法分别用5株EV71分离株攻击Balb/c乳鼠,比较毒力差异;免疫6～8周龄Balb/c小鼠后收集血清,ELISA检测抗体效价,微量中和实验检测中和抗体效价;反转录获得5株EV71的全长cDNA进行全基因组测序;最后,用CLC Main Workbench 5.5软件对序列进行比较分析。结果通过对VP1基因的比较分析发现,这5株EV71分离株均为C4a亚型。1周龄Balb/c小鼠经脑部注射LCH01株,表现出后肢瘫痪和后继死亡;而注射其它4株EV71的小鼠在观察了14 d之后仍然存活。5株EV71血清抗体效价为210～211,中和抗体效价为27～28,无显著差异。LCH01毒株与其它几株序列相比,在5′-NTR、3′-NTR、3D等处均有明显差异。结论这5株EV71分离株为近几年流行的C4a亚型,具有较高的免疫原性;LCH01毒株的毒力高于其它几株,从基因组水平上找到了差异序列,这为EV71疫苗评价和致病机制研究提供了实验数据和实验材料。     

纤维蛋白黏合剂免疫原性的研究

目的研究纤维蛋白黏合剂的潜在免疫原性。方法建立间接ELISA法检测抗体条件;新西兰白兔创伤实验及Balb/c小鼠实验考察纤维蛋白黏合剂的免疫原性。结果新西兰白兔创伤实验中,给药一周后兔体内即可检测出抗体,给药2周后抗体水平明显升高,6周后开始下降。各组血清滴度均呈现先上升后下降的趋势;小鼠实验中,纤维蛋白黏合剂作用于小鼠后,高、中、低各剂量组均能够激活小鼠的免疫系统,增强嗜中性粒细胞的吞噬功能;增加小鼠免疫器官重量及脾细胞的转化能力。结论研究表明,纤维蛋白黏合剂对于兔诱发特异性抗体,对小鼠表现出明显的免疫原性。     

SARS-N蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性

目的　选取SARS CoVN蛋白编码基因为研究对象 ,构建真核表达质粒PVAX1/N ,并在体外转染COS 7细胞的基础上免疫Balb/c小鼠 ,测定血清总IgG水平及诱发的细胞免疫反应。方法　用RT PCR方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约 12 6 9bp的片段 ,构建重组真核表达质粒PVAX1/N ,转染COS 7细胞后 ,用细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达 ;免疫Balb/c小鼠后 ,用ELISA方法测血清总IgG水平 ,MTS/PES比色法测定脾T淋巴细胞增殖 ,ELISPOT法测定CD8+ T淋巴细胞的活性。结果　构建的重组质粒经酶切及测序鉴定 ,与GenBank中登录的序列完全一致 ;细胞免疫化学鉴定结果显示 :重组质粒可在COS 7细胞中表达有免疫原性的SARS CoVN蛋白 ;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体 ;T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组 (P <0 .0 1)。结论　成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS CoVN ,并能诱导免疫小鼠产生特异性的抗SARS抗体及特异性的细胞免疫反应     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

用SP2/0瘤细胞核或DNA免疫同系小鼠诱导抗核抗体的产生

用SP2 / 0瘤细胞核或DNA分别免疫Balb/c小鼠均可获得IgG抗dsDNA、抗组蛋白、抗Sm、抗SS A/SS B等抗核抗体 ,类似于ConA活化的淋巴细胞的DNA免疫 ,而正常Balb/c小鼠的DNA不能诱导出抗核抗体。实验表明肿瘤细胞的DNA类似于活化细胞的DNA具有免疫原性 ,且能表位扩展到其他核成分     

溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定.结果 scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基.ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有藻弧菌一样的免疫原性.结论 成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础.     

医用生物蛋白胶及其主体成分纤维蛋白原的免疫原性研究

研究医用生物蛋白胶及其主体成分纤维蛋白原的潜在免疫原性。采用SDS-PAGE电泳、Western blot分离确定主体胶成分中的纤维蛋白原蛋白,建立间接ELISA法检测抗体条件;新西兰白兔创伤实验及BALB/c小鼠实验考察医用生物蛋白胶及纤维蛋白原的免疫原性。结果表明,生物蛋白胶主体成分以0.5μg/ml包被时,可有效检测抗纤维蛋白原抗体。新西兰白兔创伤实验中,实验组兔血清1周后出现抗体,2周后抗体水平明显升高,6周后抗体水平下降,呈先升后降的动态变化趋势;小鼠实验中,NBT试验未发现阳性中性粒细胞,MTT检测到T细胞呈现弱增殖能力。研究表明,医用生物蛋白胶主体胶成分中的纤维蛋白原在兔出现一过性抗体,医用生物蛋白胶对小鼠未表现出明显的免疫原性。     

体外急性心肌梗死早期诊断方法的研究

从人心肌中提取心肌肌凝蛋白轻链(CMLC),免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞做常规融合,制备单克隆抗体.通过抗人心肌肌凝蛋白轻链单克隆抗体的相加指数、亲和常数测定和抗体夹心实验,筛选到配对较好的两对单抗,在此基础上建立起轻链夹心ELISA方法,为临床急性心肌梗死早期诊断方法研究提供条件.     

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。     

Allergenicity assessment of transgenic mustard (Brassica juncea) expressing bacterial codA gene

BACKGROUND: Assessing the allergenicity and toxicity of genetically modified (GM) crops is essential before they become a regular part of our food supply. The present study aimed to assess the allergenicity of Brassica juncea (mustard) expressing choline oxidase (codA) gene from Arthrobacter globiformis that provides resistance against abiotic stresses. METHODS: SDAP, Farrp, and Swiss-Prot databases were used to study allergenicity of choline oxidase. Digestibility of choline oxidase was assessed in simulated gastric fluid (SGF). Specific immunoglobulin E (IgE) reactivity of native and GM mustard was compared by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and skin tests in respiratory-allergic patients. Allergenicity of GM and native mustard proteins was compared in Balb/c mice. RESULTS: Choline oxidase showed no significant homology with allergenic proteins in SDAP and Farrp databases. Cross-reactive epitope search showed a stretch similar to Hev b 6 having some antigenic properties. Purified choline oxidase showed complete degradation with SGF. Skin prick test of native and GM mustard extract on respiratory allergic patients showed significant correlation (P < 0.05). ELISA with 96 patients' sera showed comparable IgE reactivity. Balb/c mice immunized with native and GM mustard proteins showed low IgE response. Presensitized mice on intravenous challenge with Brassica extract showed no anaphylactic symptoms unlike ovalbumin (OVA) sensitization that showed anaphylactic reaction in mice. Lung histology of OVA-sensitized mice showed narrowing of airway and large eosinophilic infiltration, whereas native and GM Brassica extract showed normal airway. CONCLUSION: Genetically modified mustard with the codA gene possessed allergenicity similar to that of native mustard and no enhancement of IgE binding was observed due to genetic manipulation.