伴有NPM1基因突变的急性髓细胞白血病患者的临床特征

目的分析急性髓细胞白血病（AML）的NPM1（Nucleophosmin）基因第12外显子突变,探索伴有NPM1基因突变的AML患者的临床特征。方法随机选择98份临床确诊的急性白血病和骨髓增生异常综合征（MDS）患者的冻存骨髓细胞标本,其中78份AML、10份急性淋巴细胞白血病（ALL）和10份MDS提取DNA,行多重PCR,同时扩增NPM1基因第12外显子及FLT3基因第14、15外显子,PCR-毛细管电泳同时检测NPM1和FLT3-ITD基因突变。结果 78例AML患者共检出21例（26.9%）具有NPM1基因突变,10例ALL和10例MDS均未检测出该突变。78例AML中52例核型正常,NPM1阳性19例（36.5%）,26例异常核型AML患者NPM1阳性仅2例（7.7%）,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。AML-M2、M5患者NPM1基因突变发生率高于其他组。NPM1突变型AML患者WBC中位数为42.0（16.3～102.0）×10^9/L,野生型为14.0（3.4～67.2）×10^9/L,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。21例NPM1突变型AML中12例（57.1%）同时伴有FLT3-ITD,57例NPM1野生型患者13例（22.8%）出现FLT3-ITD突变,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。NPM1阳性FLT3阴性患者9例中8例（88.9%）获得CR1,NPM1阳性FLT3阳性12例中3例（25%）获得CR1,NPM1阴性FLT3阴性33例中16例（48.5%）获得CR1,NPM1阴性FLT3阳性13例中2例（15.4%）获得CR1,组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 NPM1基因突变是AML患者常见的一种突变,尤其是染色体核型正常AML患者发生率较高。伴有NPM1突变的AML患者的临床特征为年龄高,外周血白细胞高,更常见于M2和M5中,伴随FLT3-ITD突变发生率高,CR1率较高。     

C-kit、NPM1、FLT3基因突变在656例中国急性髓系白血病患者中的分布及其对预后的影响

目的 探讨急性髓系白血病(AML)患者中C-kit、NPM1、FLT3基因突变的发生率和分布情况,并分析其对预后的影响.方法 应用基因测序方法分别检测656例AML患者C-kit基因8、17号外显子,NPM1基因12号外显子,FLT3基因20(酪氨酸激酶区,TKD)、14、15号外显子(内部串联重复,ITD)基因突变情况,并随访患者的预后.结果 656例AML患者中检出C-kit基因8号外显子突变6例(0.9％),17号外显子突变33例(5.0％),NPM1基因突变169例(25.8％),FLT3-TKD突变46例(7.1％),FLT3-ITD突变178例(27.1％).至少有1个突变的患者341例(50.3％).C-kit的8号外显子检测到6种突变类型;C-kit的17号外显子检测到8种突变类型;NPM1检测到15种突变类型,其中10种类型已有报道(A、B、C、D、Nm、I*、J、J+、S、13),5种类型未见报道;TKD检测到11种突变类型.t(8;21)/M2患者常伴有C-kit的17号外显子突变;inv(16)/M4患者常伴有C-kit的8号外显子突变;M3患者中除FLT3基因突变外未检测到其他突变.NPM1和ITD基因突变多见于正常核型患者,在形态学亚型中多见于M5和M1,阳性病例多伴随高白细胞计数、骨髓原始细胞增多、CD34低表达和CD33高表达.随着发病年龄的增长,突变数量增多,白细胞计数平均值增高,高白细胞计数的患者比例升高.在正常核型的群体中突变阳性的比例较其他群体增高,2种、3种突变的比例增多,差异均有统计学意义(P值均＜0.01).FLT3-ITD突变阳性病例中位生存时间(10.0±1.2)个月,与阴性群体中位生存时间(17.0±2.4)个月相比差异有统计学意义(P =0.004),单独NPM1突变与否对总生存率没有显著影响,但NPM1+/ITD-患者的总生存率最高.结论 C-kit、NPM1、FLT3基因突变类型及数量在MICM分型中都有特殊的分布,并与白细胞计数、骨髓原始细胞数和预后均有相关性.对染色体核型正常的患者,基因突变可作为判断预后新的分子标志.     

微芯片电泳及毛细管电泳在筛查急性髓系白血病 FLT3-ITD 基因突变中的应用研究简

本研究旨在比较微芯片电泳及毛细管电泳在急性髓系白血病（AML）FLT3-ITD基因突变检测中的可靠性.应用PCR-微芯片电泳和PCR-毛细管电泳法同时检测214例初治AML患者DNA样本FLT3-ITD基因突变,并通过直接测序法进行序列分析.PCR-微芯片电泳结果显示,FLT3-ITD突变阴性151例,阳性58例（58/214,27.1％）,可疑阳性5例（5/214,2.3％）;PCR-毛细管电泳结果显示,FLT3-ITD突变阴性147例,阳性67例（67/214,31.3％）.在毛细管电泳结果为阳性的67例样本中,其中4例微芯片电泳结果为阴性,5例为可疑阳性,用直接测序法进行检测,结果均为突变阳性.这一结果揭示,PCR-毛细管电泳法用于检测FLT3-ITD突变更为准确,虽然微芯片电泳组与毛细管电泳组FLT3-ITD突变检测阳性率并无显著差异（卡方检验,P＞0.05）.结论：PCR-微芯片电泳与PCR-毛细管电泳均可作为简便的FLT3-ITD基因突变筛查方法,但作为新的检测手段,PCR-毛细管电泳法准确度与测序法一致、可用,而PCR-微芯片电泳法作为诊断检测的方法,其准确度有待于改进.     

急性髓系白血病NPM1基因突变检测的临床意义

目的 探讨初诊急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者NPM1基因突变发生率及其与染色体核型和FAB亚型之间的关系,并分析NPM1基因的突变类型.方法 选取2004至2010年中日友好医院血液科99例初诊AML患者.采集患者骨髓标本,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增基因组DNA,并采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和毛细管电泳两种方法对AML患者NPM1基因突变进行检测.应用G显带方法对其中72例初诊AML患者进行细胞遗传学分析,同时对10例NPM1突变阳性患者进行直接测序分析.NPM1插入突变在各亚型患者中发生率的比较采用x2检验.变性PAGE和毛细管电泳两种方法检测NPM1基因突变发生率的比较采用McNemar检验.结果 毛细管电泳法与变性PAGE法检测AML患者NPM1基因插入突变发生率分别为15％ (15/99)和11％ (11/99),差异无统计学意义(x2 =2.25,P＞0.05).NPM1插入突变在各亚型患者中发生率分别为:急性粒细胞白血病部分分化型(M2)(27％,8/30)、急性单核细胞白血病(M5)(32％,6/19)、红白血病(M6)(13％,1/8),差异无统计学意义(x2=1.06,P＞0.05),其余亚型未检测到NPM1插入突变.49例AML异常核型患者的NPM1插入突变发生率为4％ (2/49),23例正常核型患者的NPM1插入突变发生率为26％ (6/23),差异有统计学意义(x2=5.61,P＜0.05).10例NPM1基因插入突变均为A型突变(c.860_863 dupTCTG).突变导致NPM蛋白羧基末端读码框移,末尾7个氨基酸WQWRKSL被11个氨基酸CLAVEEVSLRK所代替.2例患者检测到内含子缺失突变,分别为IVS10-18_-15delCTTT和IVS10-17-15delTTT.结论 NPM1插入突变为AML患者常见基因改变,正常核型患者插入突变发生率高于异常核型患者.在NPM1基因内含子区发现2例缺失突变.     

Ion Torrent PGMTM测序在急性髓系白血病检测中的应用

目的探讨Ion Torrent PGMTM测序平台用于急性髓系白血病(AML)患者基因突变检测的可行性。方法提取27例AML患者初次治疗前的骨髓DNA,用Ion Torrent PGMTM测序仪对50个常见的肿瘤基因热点突变区进行检测,同时用Sanger测序法检测FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)和核仁磷蛋白1(NPM1)基因的突变情况以进行验证。结果 50个目标基因中检出17个基因共29个突变位点,单个基因有多种突变方式,以单碱基替换为主。突变频率最高的是NPM1(22.2%)和FLT3(18.5%)。用Sanger测序法验证,NPM1两种方法检测的吻合度为100%,在FLT3验证中,其中有1例Sanger测序为阳性,而Ion Torrent PGMTM检测为阴性。结论 Ion Torrent PGMTM能够在短时间内得到AML患者的基因突变谱,但其在检测长片段插入/缺失中的缺陷仍需改进。     

初诊急性髓系白血病 NPM1 突变患者临床特征的研究简

本研究探讨急性髓系白血病（AML）患者NPM1基因第12外显子突变的临床特点及其与FLT3-ITD和IDH1突变的相互关系.收集AML患者骨髓标本,收集患者的临床资料,按WHO标准诊断分型.抽提基因组DNA,采用PCR后测序方法检测NPM1突变.结果表明,对389例AML的标本检测发现,NPM1突变的发生率为14.1％ （55/389）;FLT3-ITD突变的发生率为14.7％ （57/389）,IDH1突变的发生率为6.4％ （25/389）.在AML1-ETO、PML-RARA和CBF-MYH11融合基因的AML中没有发现NPM1突变,NPM1突变组FLT3-ITD和1DH1突变的发生率分别为29.1％和12.7％,显著高于NPM1未突变组的12.3％和5.4％.NPM突变易于发生在正常核型AML中,发生率为26.5％（35/132）.NPM1突变的AML具有发病年龄偏大、血小板数高、易于发生在AML-M5、CD34阳性比例低、易于与FLT3-ITD和IDH1突变伴发等临床特点.NPM1突变阴性组的1个疗程CR率为69.8％,NPM1突变阳性组的1个疗程CR率为72.2％,两组之间无统计学差异（P=0.07）.结论：NPMI突变的AML具有独特的临床特点,易于与FLT3-ITD和1DH1突变共存,而不会与AML1-ETO、PML-RARA和CBF-MYH11融合基因共存.     

FLT3-ITD阳性急性髓系白血病患者ITD特征分析

本研究分析FLT3-ITD阳性初诊急性髓系白血病(AML)患者FLT3基因突变型与野生型等位基因比值(AR)、ITD数量、ITD长度和部分患者ITD插入位置,以及AR与临床疗效之间的关系。聚合酶链反应(PCR)扩增31例FLT3-ITD阳性AML患者FLT3基因外显子14-15,毛细管电泳法分析31例患者FLT3基因AR、ITD数量和长度,并对其中13例患者FLT3基因PCR产物直接测序。结果表明,31例FLT3-ITD阳性的AML患者中AR范围为0.01-2.8;28例(90.32%)患者ITD为1条,3例(9.68%)患者ITD多于1条;ITD长度3-144 bp不等。13例测序患者中4例ITD插入序列为FLT3野生型完全重复,2例为完全陌生碱基插入,7例为野生型部分重复。13例测序患者中ITD插入序列发生在p.E573位至p.P606位之间,多集中于p.F590-p.R595之间。AR≥0.5患者的CR率(16.67%)低于AR<0.5患者的CR率(43.75%)(p>0.05)。结论:FLT3-ITD阳性AML患者中ITD长度和AR范围变化较大。部分患者插入序列为陌生碱基,13例测序患者ITD插入位置较集中,均位于近膜区。AR≥0.5的患者CR率与AR<0.5的CR率相比无统计学差异。     

急性髓系白血病NPM1基因突变的研究

本研究旨在探讨急性髓系白血病（AML）患者NPM1基因突变情况及临床特征。采用PCR扩增产物直接测序法检测33例AML患者NPM1基因第12外显子的突变情况,了解NPM1基因突变阳性患者的临床特征。结果显示：33例AML患者中共检出8例（24．2％）具有NPM1基因突变,其中M1 1例、M2 3例、M4 1例、M3 3例。19例正常核型AML患者中7例（36．8％）发生NPM1基因突变,明显高于异常核型组（14例中1例,7．1％）（P〈0．05）。NPM1基因突变型患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞计数均高于野生型组（P值均〈0．05）。结论：NPM1基因第12外显子的突变多见于正常核型AML患者,突变患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞数量增多。     

双重PCR检测急性髓系白血病FLT3-ITD和NPM1基因突变

本研究旨在建立一种同时筛查FLT3-ITD突变和NPM1突变的检测方法。设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和FLT3基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点。对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双重PCR产物通过毛细管电泳分离,根据野生型产物和突变型产物的大小差异来判断突变存在与否并利用产物的峰面积对突变比例进行定量,并对突变阳性标本进行测序验证。结果表明,在93例标本中NPM1突变者17例(18.5%),FLT3-ITD突变者15例(16.3%),NPM1突变和FLT3-ITD突变双阳性6例。17例NPM1突变中7例M2、4例M4、5例M5、1例M6,其中10例男性、7例女性;有15例为A型,1例为B型,1例为Nm型;有1例CML急变为AML的标本中带有NPM1基因A型突变。15例FLT3-ITD阳性中1例M1、8例M2、2例M3、1例M4、3例M5,其中5例男性、10例女性。扩增产物测序结果进一步证明了该检测体系的准确性和可靠性。结论 :建立了同时筛查FLT3-ITD突变和NPM1突变的检测体系,该体系以基因组DNA为模板,具有方便、快捷、准确、可定...     

急性髓系白血病患者NPM1基因突变分析

目的研究成人急性髓系白血病（AML）患者的NPM1基因第12外显子突变的发生率及临床特征。方法采用PCR扩增产物直接测序法或毛细管电泳法检测101例成人AML患者（M0 1例，M1 17例、M2 25例、M3 23例、M4 7例、M5 25例、M6 3例）NPM1基因第12外显子的突变情况，了解NPM1基因突变阳性患者的临床特征。结果101例AML患者中共检出32例（31．7％）具有NPM1基因突变，其中M 01例、M1 9例、M2 7例、M4 2例、M5 13例。59例正常核型AML患者中27例（45．8％）发生NPM1基因突变，明显高于异常核型组（42例中5例，11．9％）（P〈0．001），且多见于M1和M5。NPM1基因突变型患者年龄相对较大（P〈0．05），外周血白细胞高，CD34和CD117表达水平低（P值均〈0．05）。对突变型患者的序列分析发现5种已知的NPM1基因突变类型（分别是A、B、D、NM、PM型突变），在1例患者中还发现了一种新型突变（暂命名为S型）。结论NPM1基因第12外显子的突变多见于正常核型AML患者，M1和M5患者更为多见，突变患者年龄较大，外周血白细胞数量高，并与CD34和CD117低表达相关。     

多重PCR结合毛细管电泳检测FLT3及NPMl基因突变的实验方法的研究

目的建立一种便捷可靠的实验方法能够同时检测FLT3基因突变及NPMl基因突变。方法设计多重PCR结合毛细管电泳（CE）方法同时检测75例初诊急性白血病（AL）患者FLT3基因及NPMl基因突变发生情况。结果应用多重PCR结合CE方法在75例AL患者中检测到FLT3-ITD突变阳性28例,FLT3一TKD突变阳性5例,NPMl突变阳性20例,9例同时存在FLT3．ITD及NPMI基因突变,l例同时存在FLT3．ITD及FLT3．TKD突变。结论多重PCR结合cE是一种能同时检测FLT3基因和NPMl基因突变的便捷可靠的方法,对判断AML患者的临床预后、指导分层治疗有重要意义,有进一步推广的价值。     

双重PCR检测急性髓系白血病FLT3-ITD和NPM1基因突变

本研究旨在建立一种同时筛查FLT3-ITD突变和NPM1突变的检测方法.设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和FLT33基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点.对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双重PCR产物通过毛细管电泳分离,根据野生型产物和突变型产物的大小差...     

急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者NPM基因突变的研究

目的探讨染色体核型正常的急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）患者NPM基因突变。方法染色体核型正常的AML患者40例（初治28例，首次完全缓解期12例），MDS患者33例，用基因组DNAPCR法扩增NPM基凶第12外显子，PCR产物纯化后直接测序，发现突变患者，将PCR产物克隆至pUCm—T载体，转化大肠杆菌DH5α，至少挑选5个以上重组克隆，小量制备质粒后进行测序。结果共发现NPM突变患者6例（AML4例，MDS2例），A型突变4例，B型突变1例，新发现突变1例（命名为R型）。结论新发现了一个NPM突变类型，并在国内外首次证实MDS患者也存在NPM基凶突变，为进一步研究NPM突变与AML及MDS发生的关系提供了重要线索．     

Denaturing high-performance liquid chromatography: a valid approach for identifying NPM1 mutations in acute myeloid leukemia

NPM1 gene mutations are the most frequent genetic lesion in the 60% of adult acute myeloid leukemias (AMLs) with normal karyotype and no evidence of typical fusion genes (BCR/ABL1, PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, DEK/CAN). Using direct sequencing we previously identified six different heterozygous mutants within exon 12 encoding the nucleophosmin C-terminus. Because of these mutations the shuttling protein nucleophosmin is aberrantly delocalized in the cytoplasm of leukemic cells (NPMc+). Here, we designed and tested a denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) assay to detect NPM1 mutated variants. To assess specificity, sensitivity, reliability, and reproducibility, we analyzed DNA from 120 primary adult AMLs and compared DHPLC results with immunohistochemistry and sequencing. All electropherogram profiles in the 26 NPMc+ leukemias were different from the wild type, indicating 100% sensitivity. Sequencing categorized mutations A, B, and D, and all mutation A cases gave identical elution profiles. The other mutations showed typical chromatograms, with mutations B and D differing for one nucleotide. Elution profiles and sequencing also identified four new variants. Our results suggest that DHPLC detects NPM1mutations as well as direct sequencing and immunohistochemistry, providing a helpful approach in the diagnosis of NPMc+ AML.     

急性髓系白血病患者NPM1、FLT3和C-KIT基因突变的检测及其预后分析

本研究旨在评估NPM1、FLT3和C-KIT基因突变在急性髓系白血病（AML）患者中的发生频率和对预后的影响,并探讨这些突变与临床特点、细胞遗传学及生存情况的关系。对我院2010年8月至2012年10月收治的78例初治AML患者,采用PCR扩增产物直接测序法或毛细管电泳法检测NPM1、FLT3和C-KIT基因的突变情况,了解这些突变阳性患者的临床特征。结果显示,NPM1突变患者在AML中的发生率为14.1%,在正常核型AML中的发生率为26.7%。NPM1基因突变者发病年龄偏高（P〈0.05）,外周血白细胞和血小板数高（P〈0.05）,CD34低表达（P〈0.05）,而在性别比例、骨髓原始细胞比例、血红蛋白浓度、CD117和HLA-DR表达水平、完全缓解（CR）率、总生存（OS）率、复发率方面差异无统计学意义（P〉0.05）。78例AML患者中9例（11.5%）FLT3-ITD突变阳性,3例FLT3-TKD（3.8%）突变阳性,无同一患者同时发生这两种突变;FLT3-ITD突变者外周血白细胞和骨髓原始细胞比例较高（P〈0.05）,总生存率偏低（P〈0.05）,多见于正常核型（P〈0.05）,而在性别比例、年龄、外周血血小板数、血红蛋白浓度、完全缓解率、复发率方面差异无统计学意义（P〉0.05）。FLT3-TKD突变例数较少,未单独进行统计学分析。6例（7.7%）C-KIT突变阳性。C-KIT突变在异常核型AML中的发生率较高（P〈0.05）,复发率较高（P〈0.05）,总生存率较低（P〈0.05）,而在性别、年龄、骨髓原始细胞比例、外周血象、完全缓解率方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：NPM1、FLT3和C-KIT突变检测有利于指导AML患者的治疗及预后评估。     

急性髓系白血病NPM1基因突变检测方法的研究

本研究旨在建立检测急性髓系细胞白血病(AML)患者NPM1基因突变的方法。针对NPM1基因突变集中区域设计引物/探针,建立高分辨熔解曲线方法(HRM)和等位基因特异PCR方法(AS-PCR),通过89份AML标本进行了临床评估,并采用毛细管电泳法(CE)和测序法作为对照进行了验证。结果表明,通过上述4种方法共检出阳性标本17例(19.1%),其中A型突变15例,B型和Nm型突变各1例。上述方法中HRM法检测全面,灵敏度为5%,而AS-PCR法有一定的漏检,但灵敏度高达0.01%。结论:考虑到操作的难易程度,同时也结合临床样品的检测情况,HRM在临床上可法用于NPM1突变筛查,而AS-PCR法可用于后续的微小残留病定量检测。