弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒的构建

目的构建弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.方法从接种了弓形虫三种不同毒株RH株、桂弓株、B36株的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA.应用PCR技术,分别扩增出三个不同虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段.将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性.结果获得弓形虫三种不同毒株GRA1目的基因片段为785 bp.构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定与预期理论值相符.结论成功构建了弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.进行弓形虫不同毒株的GRA1基因测序,为研究其同源性及进一步应用研究创造了条件.     

癌胚抗原真核表达质粒的构建

目的 癌胚抗原（CEA）是1种国际上公认的肿瘤标志物，是某些肿瘤诊断和治疗的靶分子，为了增强表达CEA的重组质粒对肿瘤的免疫防治效果，我们构建了1套表达CEA的真核表达质粒。方法 运用基因工程技术将编码人CEA全长2.4kb cDNA片段插入到表达载体pCI-neo中，用限制性内切酶法对其进行鉴定。结果 构建的重组质粒含有2.4kb CEA cDNA片段，且正向插入。结论 这为更好地研究CEA的重组质粒对CEA阳性肿瘤的免疫效应打下基础。     

弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.     

弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定

目的 构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法 采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞（HFF）进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。 结果 经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定, AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论 成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。     

PcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建

目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。     

重组弓形虫GRA7的纳米金免疫传感器检测弓形虫GRA7抗体

目的:建立基于重组弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)的纳米金免疫传感器检测血清GRA7抗体,评价其检测性能.方法:体外合成gra7基因,构建重组表达质粒pQE-60-gra7,表达并纯化GRA7,Western blot鉴定其免疫活性;种子生长法制备金纳米棒,构建GRA7的纳米金免疫传感器检测人血清GRA7抗体,评价其灵...     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达

目的:为探究葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响,构建必要的分子工具。方法:以pcDNATM4/TO/myc-His B为载体,构建在GLUT1第一个胞外区插入2×FLAG标签的重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。将重组质粒转染到NIH/3T3细胞中,利用Western印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量和细胞表面FLAG-GLUT1的表达水平。结果:酶切鉴定及DNA测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。通过识别FLAG标签,利用Western印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达,流式细胞术结果显示,转染重组质粒的细胞表面可检测到FLAG-GLUT1的表达,阳性群比例为（21.46 ± 2.375）%,明显高于对照组（0.01±0.00）%,差异有统计学意义（t=9.035,P<0.01）。结论:成功构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1,为研究GLUT1蛋白磷酸化在疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。     

弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记质粒的构建与鉴定

目的 构建弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记的黄色荧光超表达质粒,为进一步研究弓形虫新基因WX2的功能提供工具.方法 采用PCR扩增出编码wx2目的 基因,用BglⅡ,AvrⅡ分别对PCR扩增产物和ptubYFP-YFP/sagCAT进行双酶切.将wx2定向克隆到tubYFP-YFP/sag-CAT;对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果 特异扩增出预计wx2目的 基因片段,大小为558 bp;扩增产物成功连接到ptubYFP-YFP/sagCAT中,经PCR,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有基因wx2读框.结论 成功构建弓形虫新基因wx2黄色荧光超表达质粒wx2一tub-YFP sag/CAT.     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。