大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

BDNF基因重组逆转录病毒载体pLCNX-BDNF的构建与鉴定

目的 构建含脑源性神经营养因子（BDNF）基因的逆转录病毒载体（pLCNX）质粒。方法 利用多克隆酶切位点正各黏端连接，转化大肠杆菌感受态细菌DH5a获得质粒，双酶切电泳和PCR方法初步鉴定，并提交DNA测序工作站进行测序分析。结果 重组构建的质粒pLCNX-BDNF完全正确，含有全长小鼠BDNF基因片段。结论 获得正确的含全长BDNF基因的pLCNX-BDNF质粒，可以作为今后小鼠耳蜗内转基因实验的基因来源。     

复制缺陷型人TPO重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建并鉴定携带人TPO基因的复制缺陷型重组腺病毒.方法:将含全部编码序列的人TPOcDNA克隆于腺病毒载体穿梭质粒pCA3的CMV启动子下游,然后与含有腺病毒基因组的质粒pBHG10共转染293细胞,经同源重组产生人TPO重组腺病毒(AdCMVTPO);体外转染A549细胞并检测其表达活性.结果:扩增后获得的病毒滴度达4.5×109pfu/ml,经体外转染A549细胞检测到TPO的表达.结论:所构建的重组腺病毒能有效介导人TPO基因的转移,可望用于造血功能重建的基因治疗研究.     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

PML重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的：构建携带PML目的基因的重组腺病毒载体（Ad-pml）。方法：应用基因重组技术将PSG-CMV和PSG5-PML分别用EcoRI和BglII双酶切,构建PSG-PML载体。将质粒PSG-PML与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3共转染至293细胞,产生含PML基因的重组腺病毒（Ad-pml）,并经PCR及DNA测序鉴定。结果：经PCR反应可扩增出1767bp大小的片段,测序结果检测Ad-pml序列正确,通过免疫荧光反应证明病毒包装成功并且具有感染力。结论：成功构建了重组腺病毒载体（Ad-pml）,为研究肿瘤基因治疗提供了基础。     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

携带神经导向因子netrin-1基因的重组腺病毒构建

目的:制备并构建神经导向因子netrin-1(NT-1)和EGFP双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续的基因转染做准备.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因NT-1,并将目的基因克隆入含有报告基因EGFP的穿梭载体pDC316质粒;构建的质粒pDC316-netrin经酶切及测序鉴定正确后.通过脂质体lipofeetamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGlox_E1.3Cre共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后得到携带鼠NT-1的重组腺病毒Ad5-netrin-CMV-EGFP.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒.以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠NT-1基因,病毒滴度为5.2×109pfu/ml,EGFP活性检测腺病毒感染阳性细胞率在40%以上.结论:成功制备Ad5-netrin-CMV-EGFP腺病毒,为以后基因治疗研究打下基础.     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

PTEN基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含PTEN基因的重组腺病毒载体,为PTEN进行肺腺癌的基因治疗奠定基础。方法用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断和PSUCMV的大片断,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果经双酶切和PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,TCID_（50）法测定病毒滴度为1.0×10^10pfu/ml。结论成功构建了含PTEN基因的重组腺病毒载体Ad-PTEN,为下一步体内外实验证实PTEN对肺癌的抑制作用研究打下基础。     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

NME1重组腺病毒构建及表达鉴定

目的：应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为10^10 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。