日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团（TSP2HD）基因合成、表达与免疫原性研究

目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团（TSP2HD）基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD（aa107～aa182）完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察TSP2HD融合蛋白表达情况。用谷胱甘肽（GST）融合蛋白纯化胶（glutathione sepharose 4B）从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白。通过蛋白质印迹（Western blotting）分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数（cpm）值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性。结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致。含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量（Mr）约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白。凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白。Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性。     

重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建基因工程菌株,获得重组蛋白Sj-FABPc(日本血吸虫脂肪酸结合蛋白).方法用PCR法从日本血吸虫cDNA文库中扩增Sj-FABPc基因片段,再将该片段重组于pGEMT中并进行DNA测序鉴定,经酶切后将目的片段构建成重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc,转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionTM Protease酶对融合蛋白进行分离,获得纯化的14kDa Sj-FABPc.SDSPAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定.结果获得pGEX-6P-1/Sj-FABPc菌株,分离纯化出14kDa Sj-FABPc,表达量为10.52mg/L.Western blot显示,表达蛋白能被日本血吸虫免疫兔血清识别.结论重组蛋白Sj-FABPc可高效表达并有良好的抗原性.     

人胰腺癌Hedgehog信号通路中膜蛋白受体PTCH的纯化

目的 构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法 从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA，经RT—PCR扩增出PTCH基因，经纯化、回收目的基因PTCH，将其插入表达载体pET22b，转化E．Coli BL21-CodonPlus^（TM）-RP，构建重组质粒pET22b／PTCH，IPTG诱导表达融合蛋白，免疫印迹进行鉴定，Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白。结果 从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789bp PTCH目的片段，成功构建重组质粒pET22b／PTCH，并诱导表达目的蛋白；经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白。结论 成功构建了重组质粒pET22b／PTCH，并获得纯化的融合蛋白，为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具。     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。     

日本血吸虫腺苷脱氨酶基因的克隆和融合表达

目的 克隆和表达日本血吸虫（Sj）腺苷脱氨酶（ADA）编码基因，分析该基因的系统发育及预测其编码蛋白的空间结构。 方法 根据表达序列标签（EST）测序的结果设计引物，PCR法从含有SjADA基因的cDNA克隆中扩增得到该编码基因片段，亚克隆入原核表达载体pET32中表达，表达的融合蛋白用螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析纯化。采用 MrBayes算法构建系统发育进化树，用自动蛋白注释工具(DS GeneAtlas)软件模拟SjADA的蛋白空间结构。结果 获得SjADA基因全长为1 059 bp的编码序列，并克隆、表达和纯化了重组蛋白（SjADA）。生物信息学分析显示，该基因与曼氏血吸虫的同源基因之间的序列一致性仅25%，属于不同的亚家族。其空间结构与PDB模板1A4M的一致性为41%，具有相似的二级结构和相应的活性位点残基。 结论 获得了SjADA重组蛋白。提示日本血吸虫嘌呤补救合成代谢途径与曼氏血吸虫有差异。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因[Parasitol1]真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK一Sj14—3—3，为进一步对重组蛋白的融合表达及保护性免疫的研究提供条件。方法 根据日本血吸虫14—3—3蛋白的核苷酸序列。设计合成一对引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板，用RT-PCR法合成日本血吸虫中国大陆株14-3—3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM—T载体，经双酶切及PCR鉴定后，再亚克隆入pBK—CMV真核表达质粒，构建重组质粒pBK-Sj14—3—3，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果 RT-PCR产物、pGEM—T-Sj14—3—3及pBK-Sj14—3—3分别经双酶切均获得一特异性基因片段．经测序分析后该片段具有一个753bp完整开放阅读框(open reading frame，ORF)，由此推导的氨基酸序列具有多种蛋白激酶的磷酸化位点。结论 成功地构建了日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒。并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析。     

日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

日本血吸虫未知基因的原核表达载体的构建和表达分析

目的 构建日本血吸虫未知基因的原核表达载体，研究基因性质，方法 首先将从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选得到的未知基因cDNAJAYL0230亚克隆入原核表达载体pET28a( )中，IPTG诱导重组蛋白的表达，免疫印记实验检测其免疫性质。结果 成功构建重组原核表达载体pET28a( )-JAYL0230，并获得稳定表达的融合蛋白，免疫印记实验证明该融合蛋白具有免疫反应性。结论 本实验为进一步深入研究该基因的性质及功能提供了基础。     

日本血吸虫TβRII样基因胞外段的克隆、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫TGF-β受体II(TβRII)样基因的cDNA完整序列,克隆、原核表达其胞外段蛋白序列,并进行初步免疫学分析。方法应用RACE方法获得SjTβRII样基因cDNA全长序列,构建其胞外段(即N端)原核表达载体,在大肠埃希菌中IPTG诱导表达,表达产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。纯化重组蛋白并免疫大鼠制备抗血清,应用Western Blotting方法初步鉴定重组蛋白。结果获得日本血吸虫SjTβRII样基因的cDNA全长序列,为2283bp,编码760个氨基酸,其中胞外段长531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性和抗原性。结论首次获得日本血吸虫TβRII样基因的cDNA全长序列,其胞外段可在原核表达系统中获得具有免疫原性和抗原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.