几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较

目的：使人们在提取土壤总DNA时,可以根据不同的要求选用不同的方法。方法：选用了5种现在较常用的土壤微生物总DNA提取方法从水稻田土壤中提取总DNA,并对5种方法提取的DNA的质量和数量进行比较评价。结果：5种方法都可以从土壤中提取到长度大于48kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异。土壤总DNA都不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增得到相应的片段。结论：Bourrain法和Martin-Laurent法可以较快地提取出DNA,Martin-Laurent法提取的DNA的量最多,Tiedje法和Janssen法提取的DNA片段最大,Janssen法提取的DNA纯度最高,Reddy法提取的DNA的完整性和PCR扩增效果最好。     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA

目的探索一种快速、高效提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA的方法。方法采用Chelex-100法提取14株革兰氏阳性杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增16SrRNA基因及4个单拷贝管家基因以评价提取核酸的质量。结果 Chelex-100法能够在20min内从革兰氏阳性杆菌中提取出基因组DNA,所提取的DNA可直接用于PCR扩增。所有菌株的16SrRNA基因及棒状乳杆菌的4个单拷贝管家基因均扩增成功,PCR产物经电泳检测目的条带清晰特异,与预期目的片段长度相符。结论 Chelex-100法具有快速、高效、安全、经济的特点,采用这种方法提取的革兰氏阳性杆菌的基因组DNA可直接作为PCR扩增的模板。     

古代人类牙齿DNA的提取和扩增条件研究

目的 以河南洛阳二里头遗址出土的距今3000多年的夏代人牙齿为标本，从口腔医学的角度分析牙齿DNA提取的污染控制，并进行PCR扩增条件的比较研究。方法 对古代人类牙齿样本进行去污处理，放入液氮研磨机中打磨成牙粉，使用GENECLEAN Kit for Ancient DNA试剂盒从牙粉中提取DNA分子；利用不同条件的5种PCR反应体系扩增古DNA。结果 从牙齿样本中抽提出古代DNA片段A；在PCR扩增中，加入适量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代样本中PCR抑制物的作用；适合的Mg^2＋浓度则有助于增加DNA聚合酶的活性，减少非特异性扩增。结论 古DNA试剂盒是一种有效的古DNA抽提方法；小牛血清蛋白BSA和Mg^2＋浓度对PCR反应存在影响。     

四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

目的:探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixation and paraffin embeddedtissues,FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法:采用Chelex-100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA;应用聚合酶链反应扩增100~500bp长度DNA片段,然后进行电泳分析,1年后重复PCR电泳分析。结果:小于200bp长度DNA片段扩增,Chelex-100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%,明显优于酚氯仿抽提法(15.0%)(P<0.01)及水煮法(21.3%)(P<0.01)。随着扩增长度的增加,PCR扩增效率逐渐降低,Chelex-100提取法PCR反应总阳性率为82.5%,单纯消化法为66.5%,水煮法为13.4%,酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论:Chelex-100提取法方便简单,适用于微量石蜡组织DNA扩增分析;单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。     

石蜡包埋表皮组织中β-连环蛋白基因扩增技术的建立

目的∶建立从石蜡包埋表皮组织中提取DNA ,进行 β 连环蛋白基因 3号外显子聚合酶链反应 (PCR)扩增的方法。方法∶从 14例不同重量、不同年代石蜡包埋皮肤鲍温氏病病变组织中提取DNA ,再进行 β 连环蛋白基因 3号外显子PCR扩增。结果∶5mg组织提取DNA的PCR扩增未获成功 ,而用 10mg和 2 0mg组织提取的DNA可成功扩增 ;已包埋 10年以上的 5例标本仅 2例成功扩增 ,而 9例 10年以内的标本全部成功。结论 :10mg及 10mg以上且 10年以内的石蜡包埋表皮组织可用于目标基因PCR扩增。     

浅部真菌病临床标本致病菌DNA提取方法的初步研究

目的初步建立直接从浅部真菌病临床标本中提取致病菌DNA的方法,为PCR技术快速诊断浅部真菌病及相关研究奠定基础。方法采用蛋白酶K消化法、煮沸法和冻融法处理直接镜检阳性的临床标本,以经典的酚-氯法抽提致病菌DNA,并用真菌通用引物ITS1进行PCR扩增检验。结果共收集标本61例,其中有44例PCR可扩增出特异性条带,甲屑的PCR检出率为81．0％,皮屑为69．2％;PER检测为阴性的17例中有7例标本量较少,有5例菌量较少。整个DNA提取过程约需3h。结论本研究初步建立的直接从浅部真菌病临床标本中提取致病菌DNA的方法能满足后续PCR反应的需要：DNA提取效率与标本量和菌量有关。     

用子聚合酶链反应的新鲜组织DAN快速提取法研究

结合本室实验,从人新鲜大肠癌组织中提取DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增检测癌基因突变。根据PCR对模板DNA要求不高的特点,本文在常规生化法提取DNA的基础上,采用了快速提取DNA方法,并从DNA含量、纯度及PCR扩增结果三个方面进行比较,获得满意结果。该法操作简单、省时、价廉。     

线粒体直接PCR扩增法

为建立一种不需提取线粒体DNA而直接用线粒体进行聚合酶链反应 (PCR)的方法 ,将得到的线粒体用高温加热 ,使线粒体膜破裂 ,释放DNA后 ,直接用于PCR扩增。结果 :扩增产物与提纯的线粒体DNA扩增得到的产物一样丰富。提示 :该方法适用于对线粒体DNA纯度没有特别要求的试验     

连翘干燥叶片高质量DNA的提取方法研究

目的：探讨不同DNA提取方法对连翘干燥叶片的DNA质量及RAPD—PCR标记结果的影响,找出提取连翘总DNA的最佳方法。方法：分别用常规CTAB法、高盐低pH法和改良CTAB法提取连翘总DNA．分别进行琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收A260／A280和RAPD—PCR分析,通过比较找出提取连翘总DNA的最佳方法。结果：以CTAB法为基础的改良CTAB法可获得较高质量的DNA进行PCR扩增。结论：改良CTAB法是一种分离高质量完整DNA的简便、快速方法。     

福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法对PCR的影响

目的：比较多种福尔马林固定石蜡包埋组织ＤＮＡ提取方法对ＰＣＲ的影响,探讨临床组织病理标本理想的ＤＮＡ提取方法及ＰＣＲ应用。方法：采用５种不同的ＤＮＡ提取方法应用ＰＣＲ技术进行了比较。结果：Ｔｗｅｅｎ ２０,ＮＰ ４０加蛋白酶Ｋ法和亚氨基二乙酸法处理标本时ＰＣＲ结果较为理想。结论：合适的福尔马林固定石蜡包埋组织ＤＮＡ提取方法可应用ＰＣＲ进行ＤＮＡ水平的相应的研究。     

一种从石蜡包埋组织中获取高质量基因组DNA的改良方法

目的:比较现有的DNA制备方法,建立一种从甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded tissues,FFPET)提取高质量基因组DNA的方法。方法:将传统基因组DNA提取方法与市场供应的DNA亲和层析柱结合在一起,以水浴脱腊法替代二甲苯脱腊法,设计一种改良的基因组DNA快速提取方法,从石蜡包埋宫颈癌组织标本提取基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳法和聚合酶链式反应法进行鉴定。结果:改良的基因组DNA提取法整合了水浴脱蜡与DNA亲和层析柱的优点,从石蜡包埋宫颈癌组织中获得了高质量的基因组DNA,特别是能以很高的效率回收大于20 kb的基因组DNA大片段。结论:改良的基因组DNA提取方法简单快捷,是一种从石蜡包埋组织中回收高质量基因组DNA的有效途径。     

提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究

目的 :确定从石蜡包埋组织中提取 DNA的最佳条件。方法 :改变石蜡切片厚度、组织脱蜡时间、消化液蛋白酶 K浓度、组织消化时间等参数 ,组合出 96种不同提取 DNA的条件 ,比较各种条件下所提取 DNA的数量和质量。结果 :各种条件均可以提取出一定数量的 DNA,但有些条件所提取的 DNA不适合于做 PCR及 DNA序列测定。结论 :从石蜡包埋组织中提取 DNA的最佳条件为 ,1 0 .0 μm组织切片 ;切片脱蜡 2次 ,脱蜡时间分别为 2 h和 1 2 h;消化液中蛋白酶 K浓度5 0 0 mg· L-1;组织消化 1 2 h     

三种全血提取基因组DNA方法的比较及Genomix方法的改良

目的：选择一种高效、简便快速、价格合适的从全血中提取基因组DNA的方法。方法：分别采用3种不同的方法从全血中提取基因组DNA,比较了3种方法提取的DNA的质量,以及各种方法所需时间及其费用。对其中的一种方法进行了改良。结果：3种方法提取的DNA的质量都能达到相关分子生物学实验的要求,但在操作程序、价格等方面存在差别。结论：Genomix法操作简单、快速、灵活性好、价格便宜,适合于大样本的DNA提取。     

通过石蜡包埋组织标本构建肝细胞癌基因组文库的研究

目的探讨通过石蜡包埋组织标本构建肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)肿瘤组织基因组DNA文库的方法。方法收集符合要求的石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,运用组织裂解改良法提取基因组DNA,构建HCC肿瘤组织基因组DNA文库,通过SmartSpecTM核酸蛋白测量法、TaqMan-MGB-PCR及琼脂糖凝胶电泳法等分析评估所得文库质量。结果本研究共收集到2 108例合格石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,构建了HCC组织标本基因组DNA文库,经质量监控分析所得DNA的浓度大于或接近0.1μg/μl,对应A260/A280比值介于1.6~2.0,TaqMan-MGB-PCR实时定量曲线光滑、波峰单一,琼脂糖凝胶电泳条带单一、清晰、无拖尾现象,所构建的文库DNA质量较好,与对照DNA质量相比差异无显著性(P>0.05)。结论通过石蜡包埋组织标本可构建用于HCC研究的肿瘤组织基因组DNA文库。     

石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究

目的 改良石蜡组织DNA快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性.方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DNA,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因β-Globin以确定模板DNA质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(IgH)或T细胞受体γ基因(TCRγ)重排检测.结果 快速法提取DNA的浓度虽低于对照方法,但β-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P＞0.05),对IgH和TCRγ重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均＞0.05).测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合.DNA可在-20 ℃保存至少4周.结论 快速DNA提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值.     

一种改进的提取人外周血和组织线粒体DNA的方法

目的：建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法。方法：以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚／氯仿抽提,TE或ddH2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果：用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。结论：改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。     

多重聚合酶链反应分析石蜡包埋组织多肿瘤抵制基因探讨

目的：建立一种敏感、特异和快速检测石蜡包埋组织中多肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）的方法。方法：利用改良的ＤＮＡ制备方法,成功的从甲醛固定、石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ,同时用建立的多重聚合酶合链反应（ＰＣＲ）进行检测。结果：３０例石蜡包埋的正常组织与新鲜组织提取的ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,电泳图谱都出现５３６ｂｐ和３１０ｂｐ,即结果相同。结论：轵要提取、纯化得当,石蜡包埋组织在分子生物学研究领域中将有重要应用价