靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的 设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法 应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果 测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论 成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.     

含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩.方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况.结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱.GP2-293细胞转染VSV-G 基因后可产生(7.5±1.4)×l05cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达.结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛.     

ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定.分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究.结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致.重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统.293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1.1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光.结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础.     

靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF 1α基因过度表达的干扰作用奠定基础。方法根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度。采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒。结果酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml。结论本实验成功构建了针对大鼠HIF-1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1α靶向治疗提供了良好的实验基础。     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

MMP-2基因RNAi重组慢病毒的构建

目的 构建MMP-2基因RNAi重组慢病毒,以便客观研究该基因的作用.方法 筛选确定的MMP-2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2siMMP-2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV2siMMP-2,pCMV2dR8.74和pMD2G3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建MMP-2 siRNA的慢病毒载体LV2siMMP-2,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×1010 TU/L.结论 成功构建人MMP-2基因RNAi慢病毒载体,为后期研究MMP-2基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗奠定基础.     

重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.h...     

电位滴定法与手动滴定法测定药品含量的比较

目的对比电位滴定法与手动滴定法在测定药品含量方面的效果。方法将我区医疗机构常用药物阿司匹林、盐酸左旋咪唑、氯化钠注射液作为研究对象,分别应用电位滴定法与手动滴定法对上述药品含量进行测定,并对不同检测方法下阿司匹林、盐酸左旋咪唑、氯化钠注射液三类药品的定量检测结果及相对标准偏差进行对比分析。结果对比两种检测方法下的定量检测结果,电位滴定法下对阿司匹林、盐酸左旋咪唑、氯化钠注射液的检测结果与手动电位滴定法无明显差异(P0.05)。两种检测方法下的相对标准偏差对比,电位滴定法下对阿司匹林、盐酸左旋咪唑、氯化钠注射液的相对标准偏差均显著低于手动滴定法,差异有统计学意义(P0.05)。结论电位滴定法对药品含量的检测结果准确可靠,相对标准偏差小,具有精密度高的优势,可逐步取代传统手动滴定法,并在药品含量检测分析领域中推广应用。     

用永停滴定法和外指示剂法综合校正滴定终点的探讨

永停滴定法和外指示剂法相结合可以更准确指示滴定终点。方法：以永停滴定仪的掼针偏转程度作为参考，结合外指示剂法来确定终点，避免滴定过量。结果：此法重现性好，回收率为９９．４％，结论：对于无法计算理论终点的未知药品，可防止滴定过量，更能准确判断终点，对假劣药品检验的终点判断有实际意义，可用于药品中生产中的质量控制。     

经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究

OBJECTIVE: To compare large-scale real-time titration method (LaSRT) with standard titration method by flow cytometry (FACS) for determining the titers of green-fluorescence-protein (GFP)-marked recombinant retrovirus. METHODS: (1) Standard titration method: NIH3T3 cells were inoculated at 2x10(5) /well in 6-well plate, and after cell culture for 12 h, 0.5 ml, 50 microl and 5 microl GFP-marked recombinant retrovirus (n=3) were respectively used to infect the cells, with the final concentration of polybrene being 8 microg/ml. Forty-eight hours later, the cells were treated with trypsin and assayed for the positive rate of GFP by means of FACS. When the positive rate was lower than 10%, the titer was calculated according to the equation: virus titer (TU/ml) =2x10(5)xGFP positive rate/volume of virus stock solution used. (2) LaSRT method: The cells were inoculated at 5,000 cells/well in a 96-well plate, and after cell culture for 12 h, 90 microl/well complete culture medium was used with 8 microg/ml polybrene and 10% newborn bovine serum, 10 microl virus was added into the first well, and ten-fold dilution of the previous virus-containing solution was performed before the virus was added into the next well (8 wells in each group, altogether 3 groups). Forty-eight hours later, inverted fluorescence microscope was used to observe the fluorescence-positive cells in each well. The virus titer was calculated according to the equation: virus titer (TU/ml) =mx10(n+1), where n is the serial number of the reference well, and m the number of positive cells. (3) LaSRT was used to study the influence of freezing/thawing on the titers of recombinant retroviruses. RESULTS: The virus titer obtained with standard method by FACS was (1.54+/-0.38)x10(6) TU/ml, and that of LaSRT was (1.33+/-0.57)x10(6) TU/ml (P>0.05). After one cycle of freezing/thawing, the virus titer dropped to (18.1+/-9.9)% (n=7). CONCLUSION: LaSRT is more rapid and convenient as well as easier to determine the virus titer compared with standard method, and no significant difference is found between the two titration methods.     

非水滴定法测定巴洛沙星含量

目的:建立测定巴洛沙星含量的简便方法。方法:采用非水溶液滴定法测定巴罗沙星含量。结果:三批供试品的含量均大于98.50%,精制品的含量为99.32%。结论:非水溶液滴定法成本较低、方法简便、准确和快速,可用于巴罗沙星含量测定。     

非水滴定法测定盐酸甜菜碱的含量

目的　建立测定盐酸甜菜碱含量的非水滴定法。方法　样品以冰醋酸作溶媒 ,以结晶紫为指示剂 ,用0 1mol·L-1标准高氯酸溶液进行滴定。结果　平均回收率为 99 81% ,RSD为 0 19%。结论　本方法准确、稳定、简便 ,易于推广     

非水电位滴定法测定富马酸伊布利特含量

建立了非水电位滴定测定富马酸伊布利特含量的方法。采用高氯酸标准溶液对富马酸伊布利特样品进行电位滴定,利用二级微商法确定电位滴定终点消耗的高氯酸标准溶液体积从而得出富马酸伊布利特含量,用建立的方法测得自制富马酸伊布利特样品含量为99.76%,其方法精密度RSD为0.209%。该法操作方便、准确度高,适合富马酸伊布利特的快速检测。     

电导滴定法测定N-琥珀酰壳聚糖取代度

目的建立电导滴定法测定N-琥珀酰壳聚糖取代度的方法。方法用NaOH标准溶液滴定溶解于过量HCl标准溶液中的样品,测定电导率值,计算取代度。结果该方法的RSD为1.45%,改变实验条件,取代度无显著性差异。结论该方法操作简便、快捷,重现性好。     

非水电位滴定法测定盐酸莫西沙星含量的方法研究

目的探究非水电位滴定法降发美．分析化学[M]．第6版．北京：人民卫生出版社,2007：152—179．]测定盐酸莫西沙星含量的方法。方法以0．01mol／L盐酸溶液一无水甲醇（1：8）为溶剂,用甲醇钠滴定液（O．1mol／L）进行滴定。结果非水电位滴定法：方法精密度RSD为0．46％（n=9）,平均回收率为100．O％。结论非水电位滴定法的测定结果与高效液相色谱法在统计学上无显著性差异,方法简便快速,结果准确可靠。     

DEAE-葡聚糖在SHIV病毒TCID50滴定及扩增中的作用

目的 确定DEAE-葡聚糖对CEMx174细胞的半数抑制浓度,明确其在SHIV病毒TCID50滴定及病毒扩增中的促进作用.方法 分别使用含DEAE和无DEAE的DMEM完全培养基测定SHIVchn19p7的TCID50.用无血清DMEM培养基系列稀释DEAE,加入CEMx174细胞,使用cck-8测定细胞破坏率.分别选取DEAE浓度为28.125μg/mL和14.0625μg/mL的无血清DMEM培养基对CEMx174细胞预处理3 h.再加入SHIV-KB9病毒液,定期测定培养上清中的P24水平,同时做正常病毒对照和DEAE-1640对照,比对不同处理下的病毒扩增情况.结果 使用了DEAE后,SHIVchn19p7的TCID50达到了3.16×104TCID50/mL,不使用DEAE,病毒的TCID50测定为阴性.DEAE对CEMx174细胞的IC50为44.85μg/mL.经浓度为28.125μg/mL和14.0625 μg/mL的DEAE预处理后,SHIV-KB9病毒扩增在13 d～17 d达到高峰.而用不含DEAE的1640生长液培养的实验孔在19 d才开始出现阳性反应.结论 高浓度的DEAE对细胞有较强的杀伤作用,低浓度的DEAE对细胞的破坏率较低,并且能显著促进病毒扩增.DEAE在病毒进入细胞的过程中确实起了重要的作用.