河虾中主要过敏原组分鉴定及分离纯化

目的鉴定并分离纯化河虾中引起过敏反应的主要蛋白组分。方法河虾蛋白浸液皮下注射建立小鼠过敏模型,获得高效价特异性IgE血清用于免疫印迹分析。用饱和硫酸铵分段盐析和DEAE离子交换层析纯化目的蛋白。dot-ELISA及竞争ELISA检测纯化目的蛋白的过敏原活性。结果河虾蛋白浸液皮下注射成功建立了虾过敏小鼠模型。免疫印迹分析显示虾中有一分子量36kD的蛋白组分为主要过敏原。用硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析的方法成功分离到目的蛋白。dot-ELISA证明目的蛋白能与特异性IgE反应。竞争ELISA检测纯化目的蛋白与河虾蛋白浸液竞争结合特异性IgE的活性,最大竞争抑制率可达60％。结论本实验成功鉴定并分离到河虾中一分子量为36kD的主要过敏原组分,为过敏原的分析研究提供了一套比较完整的方法。     

系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法.方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KD SSA抗原的活性,以得到纯化60KD SSA抗原的具体条件.结果 60KD SSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%.60KD SSA抗原在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3) NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm.结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KD SSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分.     

人精浆小分子抗菌肽的分离鉴定

目的 从人精浆中分离小分子抗菌肽,探讨精浆的抗菌机制.方法 收集正常人精液,室温液化后10 000 r/min离心10 min去除精子得到精浆.采用琼脂糖弥散法检测抗菌活性,采用对大肠杆菌(ATCC25922)的抗菌活性作为检测指标,通过阳离子交换柱SP-Sepharose分离,将有抗菌活性的洗脱产物冻干后用去离子水溶解,经过AKTA Superdex 75柱分离,收集小分子部分,应用反相高效液相色谱技术分离纯化多肽(RP-HPLC分离),检测各峰抗菌活性,基质辅助激光解吸质谱法检测相对分子质量,并鉴定其抗菌活性.结果 从人精浆中初步分离出多个相对分子质量小于10×103的肽混合物, 其中部分与精液凝固蛋白Ⅰ片段相对分子质量大小一致,命名为HSLAMs(Human semen low-molecular-mass antibacterial mixtures),具有抗大肠杆菌的活性.结论 HSLAMs可能是人精浆天然免疫机制中重要的效应分子,精液凝固蛋白Ⅰ可能是其来源之一.     

紫心甘薯多糖的分离及组分抑癌活性研究

目的:分离紫心甘薯的多糖(Polysaccharide of purple sweet potato,PPSP)组分,并对其组分的抑癌活性进行初步研究.方法:采用DEAE-Cellulose和CM-Cellulose离子交换柱分离紫心甘薯多糖,收集分离PPSP组分;MrTT法检测PPSP各组分对肿瘤细胞的体外抑制活性;薄层层析法分析PPSP各组分的单糖组成;利用傅里叶红外光谱技术检测PPSP组分的结构特征.结果:选用弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose分离,并经NaCl溶液梯度分段洗脱,得到4个紫心甘薯多糖组分,分别命名为PPSP Ⅰ、PPSPⅡ、PPSPⅢ和PPSPⅣ;观察PPSP Ⅰ、PPSPⅡ、PPSPⅢ对Hela和HepG2肿瘤细胞的抑制作用,检测发现PPSPⅡ、PPSPⅢ组分有一定的抑癌活性.结构分析结果表明,PPSP Ⅰ主要由葡萄糖和半乳糖这两种单糖组成;PPSPⅡ由葡萄糖组成,并具有β-D-葡萄吡喃聚糖的红外特征吸收峰;PPSPⅢ具有蛋白吸收峰.结论:成功分离得到PPSP的4种多糖组分,其中检测到PPSPⅡ、PPSPⅢ组分对Hela和HepG2肿瘤细胞具有一定的体外抑制作用.推测PPSPⅡ、PPSPⅢ组分抑癌活性可能与其含有β-D-葡萄吡喃聚糖或糖蛋白的结构有关.     

松黄蛋白组分的分离及抗原性的实验分析

目的：分析松黄蛋白抗原中致敏成分。方法：用硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶层析分离松黄蛋白质组分,以致敏大鼠腹腔肥大细胞组胺释放试验和被动皮肤过敏反应试验检测松黄蛋白组分的致敏活性。结果：松黄蛋白中含有３种抗原性不同的组分,组分Ⅱ是松黄主要抗原。结论：松黄蛋白中含有致敏组分,此蛋白组分具对热和酸碱不稳定的性质。     

肿瘤细胞蛋白质组的二维液相色谱分离

目的:建立一种利用二维液相色谱法分离肿瘤细胞全细胞裂解液的方法.方法:将肿瘤细胞裂解样品用初始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后先对二维色谱条件进行优化和重现性分析,再将一维收集的pH值8.5～4.0之间的组分分别进行二维反相HPLC分离,利用ProteoVue软件将UV图转换成胶图.结果:一维色谱聚焦分离pH值8.5～4.0之间的组分共收集到16个,每个组分的二维UV图转换成pI/UV胶图.结论:二维液相色谱分离法是一种有效的分离肿瘤细胞裂解液的方法.     

烧伤后血清中造血刺激活性组分分析

目的　检测烧伤血清中是否有异常的造血刺激活性组分出现,并对其性质作初步鉴定。方法　采用离子交 换层析分离正常及烧伤血清,用CFU -E、CFU- GM集落培养法检测各分离组分在烧伤前后造血刺激活性的变化,并对其进 行热、酸、碱和酶处理后进一步检测造血活性。结果　小鼠烧伤血清经离子交换层折后得到A、B、C、D4个组分,其中A、B 组分红系造血刺激活性增高;C组分对红系和粒系造血刺激活性增高;且活性最强。D组分不具有造血刺激活性。A、B、C 3组分经酸处理和胰酶消化后活性消失,A、B组分经碱处理和热处理后活性消失,而C组分加热70℃以及经碱处理后仍 保持部分活性。结论　①烧伤后血清经离子交换色谱分离得到的A、B、C、D4组分中,A、B组分具有红系刺激活性,C组 分活性最强,对红系和粒系均有刺激。②A、B、C3个活性组分均为蛋白质,C组分对酸不稳定,对热和碱具有一定的稳定 性,而A、B两组分既不耐热,对酸碱均不稳定。     

石决明清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的研究

目的：探讨石决明药效成分的抗氧化活性。方法：用CM-Sephadex C-25离子交换色谱（ion exchange chromatog-raphy,IEC）梯度层析分离石决明酸溶性提取物,得到各分离组分280 nm处光吸收曲线,SDS-PAGE方法分析各组分蛋白成分,最后测定了各组分的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH.）清除活性。结果：IEC梯度层析得到双峰洗脱曲线,具有较高OD280nm值的组分均显示出明显的SDS-PAGE蛋白电泳条带,DPPH.自由基清除能力实验结果表明,多个石决明IEC分离组分表现出良好的活性。结论：石决明除含有可能具有抗氧化活性的蛋白成分外,还存在可以清除DPPH.自由基的其他高活性物质。     

用Streamline SP从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HBsAg Fab最适吸附条件的选择及验证

目的 选择阳离子交换介质Streamline SP分离纯化anti-HBsAgFab的最适吸附条件。方法试管法分别测定平衡缓冲液在不同DH和不同离子强度下,阳离子交换介质Streamline SP对预分离纯化蛋白的吸附效果。用l mlSP预装柱及自装28 ml Streamline SP柱进行离子交换层析以验证吸附效果。结果NaAc-HAc作为平衡缓冲液在pH4．4、离子强度100-600mmlo/L可以使阳离子交换介质Streamline SP与蛋白吸附达到最佳效果。在该条件下用l ml SP预装柱及自装28ml SP柱进行离子交换层析,均验证了这一吸附效果。结论试管法选择的离子交换层析的最适吸附条件用于从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HbsAg Fab切实可行。     

VD3结合蛋白的分离纯化

目的纯化VD3结合蛋白(DBP)。方法利用DBP的相对分子质量及电荷性质，分别用阳离子交换剂、阴离子交换剂和凝胶过滤等分离目的蛋白，SDS-PAGE鉴定纯度，并进行活性分析。结果分离到相对分子质量为58000的蛋白质，SDS-PAGE呈单一区带。结论成功分离纯化出DBP。     

小鼠肝脏磷酸化蛋白质组的二维液相色谱分离

目的 利用二维液相色谱法分离小鼠肝脏磷酸化蛋白质组。方法 取正常小鼠肝脏,裂解肝脏后利用金属磷酸盐亲和层析树脂提取磷酸化蛋白。将磷酸化蛋白用初始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,再将一维收集的pH值在8.5至4.0之间的组分分别进行二维无孔硅胶反相高效液相色谱分离。最后利用ProteoVue软件将二维UV图转换成胶图进行分析。结果 成功提取了小鼠肝脏磷酸化蛋白,并在浓缩除盐后通过二维液相色谱分离成功建立小鼠肝脏磷酸化蛋白质组pI/UV图谱。其中,一维色谱聚焦分离pH值在8.5至4.0之间共收集16个组分,每个组分的二维UV图转换成pI/UV胶图。结论 磷酸化蛋白纯化技术与二维液相色谱技术的结合是研究磷酸化蛋白质组的有效方法,为下一步鉴定和研究磷酸化蛋白的功能打下坚实的基础。     

VD_3结合蛋白的分离纯化

目的 :纯化VD3 结合蛋白 (DBP)。方法 :利用DBP的相对分子质量及电荷性质 ,分别用阳离子交换剂、阴离子交换剂和凝胶过滤等分离目的蛋白 ,SDS PAGE鉴定纯度 ,并进行活性分析。结果 :分离到相对分子质量为 5 80 0 0的蛋白质 ,SDS PAGE呈单一区带。结论 :成功分离纯化出DBP。     

HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的:纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测.方法:采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用.结果:获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用.结论:获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性.     

海螵蛸多糖的提取分离及活性组分CPS-1的纯化

目的:从海洋中草药海螵蛸(乌贼骨)中提取分离得到多糖活性物质.对粗多糖中主要的活性组分CPS-1进行纯化,得到成分相对均一的天然活性多糖.方法:用热水抽提法提取海螵蛸多糖粗品,并对提取工艺进行正交设计,优化提取方法.对粗品组分进行总糖量测定.用DEAE-Sepharose F.F柱及Sepharose CL-6B柱对海螵蛸多糖粗品进行分离.通过活性检测实验确定活性部分.最后使用Sephacryl S-300柱进一步纯化.用HPLC来检测精品多糖的纯度.标准曲线法测定相对分子质量.结果:成功得到海螵蛸粗多糖.经过离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B柱及分子筛Sephacryl S-300柱的进一步分离纯化和活性跟踪,最后得到相对均一的活性精品多糖CPS-1,其含糖量达93.6%,相对分子质量为1×106.结论:不同的提取条件影响海螵蛸多糖的得率.不同性质的分离材料能够将相对分子质量及电荷有差异的多糖分离,达到分离的目的.精品多糖CPS-1是从海洋中草药海螵蛸中得到的均一多糖组分.     

福建产舟山眼镜蛇毒细胞毒素的快速分离纯化及鉴定

目的 从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素(CTX)，并鉴定其理化性质。方法 采用SP—Sephadex C-25阳离子交换色谱及Sephasil Peptide C18反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX，SDS—PAGE(Tris—Tricine系统)鉴定纯度，Edman降解法测定N端氨基酸序列。结果 粗毒经阳离子交换色谱，得到14个蛋白峰，其中第X～XⅢ峰具CTX活性；再分别经反相色谱纯化，得到4个CTX．总得率为32.48％；SDS—PAGE显示为均一蛋白，分子量依次为：7．28，7．33，7．24和7．38kD；测定它们N端20个氨基酸序列。结论 采用阳离子交换和反相高效液相色谱可快速、高效地从眼镜蛇毒中获得4个CTX纯品。     

VD3结合蛋白的分离纯化

目的：纯化VD3结合蛋白（DBP）。方法：利用DBP的相对分子质量及电荷性质，分别用阳离子交换剂、阴离子交换剂和凝胶过滤等分离目的蛋白,SDS-PAGE鉴定纯度，并进行活性分析。结果：分离到相对分子质量为58000的蛋白质，SDS－PAGE呈单一区带。结论：成功分离纯化出DBP。     

小鼠肝脏磷酸化蛋白质组的二维液相色谱分离

目的利用二维液相色谱法分离小鼠肝脏磷酸化蛋白质组。方法取正常小鼠肝脏，裂解肝脏后利用金属磷酸盐亲和层析树脂提取磷酸化蛋白．将磷酸化蛋白用初始缓冲液置换后，进行一维色谱聚焦分离，再将一维收集的pH值在8．5至4．0之间的组分分别进行二维无孔硅胶反相高效液相色谱分离。最后利用ProteoVue软件将二维UV图转换成胶图进行分析。结果成功提取了小鼠肝脏磷酸化蛋白，并在浓缩除盐后通过二维液相色谱分离成功建立小鼠肝脏磷酸化蛋白质组pI／UV图谱。其中．一维色谱聚焦分离pH值在8．5至4．0之间共收集16个组分，每个组分的二维UV图转换成pI／UV胶图。结论磷酸化蛋白纯化技术与二维液相色谱技术的结合是研究磷酸化蛋白质组的有效方法，为下一步鉴定和研究磷酸化蛋白的功能打下坚实的基础。     

一种快速纯化单克隆抗体的方法——阴阳双重离子交换层析法

本文介绍了一种纯化单克隆抗体的方法——阴阳双重离子交换层析法。该方法利用单克隆抗体具有带电均一性的特点,将阴离交换树脂和阳离子交换树脂集于一个层析柱内.使层析柱既可吸附阳离子也可以吸附阴离子。这样处于兼性离子状态的待纯化单抗在层析柱中走的最快,而其它一些等电点不同于待纯化单抗的杂蛋白分子则带有正电荷或负电荷,可被柱中的离子交换树脂吸附,在层析柱走的较慢,从而与待纯化单抗分离。我们用这种新型的快速柱层析法纯化了抗结肠癌3B_3单克隆抗体。其单抗纯度达到90%以上,取得了较理想的效果。     

Antiendotoxin bioactivities of Paeonia suffruticosa Andr

[目的]对传统中药牡丹皮(Paeoniasuffruticosa Andr,PSA)抗内毒素(LPs)活性组分进行定向分离及体内外活性评价.[方法]利用生物传感器、硅胶柱层析、聚酰胺层析、离子交换-HPLC等技术对牡丹皮进行活性组分的定向分离.通过活性组分对LPS介导RAW264.7分泌细胞因子的抑制实验、对LPs和热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护实验,评价所得活性组分对内毒素的拮抗作用.[结果]从牡丹皮水提取物中分离到一个与Lipid A具有较高结合活性的组分(PSA-3),PSA-3在体外能抑制LPS介导的RAW264.7细胞释放TNF-α(P45μg＜0.05,P90.180μg＜0.01),对致死剂量LPS攻击小鼠的保护率为50％(P＜0.01),对致死剂量热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护率为50％ (P＜0.05),而低结合活性PSA-1组分则不具有抑制作用,对LPS和热灭活大肠杆菌(HK-E.coli)攻击小鼠也无保护效果.[结论]从牡丹皮中分离到一个与Lipid A具有较高结合活性的组分,该组分在体内外对LPS均具有一定的拮抗作用.     

发酵液中重组水蛭素的分离纯化

目的：建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法：高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外，发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白；采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果：纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带，重组水蛭素比活性为6000ATU／mg，纯化收率达38．6％。结论：超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。