实时荧光定量PCR检测布鲁杆菌方法的应用

Objective To discuss a real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) wether if can be used to detect Brucella. Methods According to the BCSP31 gene sequences specific for Brucella, one pair of primers and one TaqMan probe were designed. A real-time PCR was developed with the BCSP31 fragments cloned into PMD18-T vector. The standard cure was established and the sensitivity, the species specificity and the stability of the assay were evaluated. The clinical blood specimens were detected by QT-PCR and compared with clinical diagnosis. Results The standard curve was established with the standard template and the relationship between the Ct and the DNA copy number was linear(r=0.999). The sensitivity of the real-time PCR was 5 copies/μl. The sensitivity of the common PCR was 5×102 copies/μl. The sensitivity was about 100 times higher than common PCR. Species specificity of this FQ-PCR assay evaluated using genomic DNA from 6 Bmcella strains and 5 non-Brucella strains and strong fluorescence was detected in all Brucella strains. The CV of intra-assay and inter-assay reproducibility were 0.71%,7.23%, reprectively. Twenty-four specimens from clinical brucellosis cases, 19 showed positive, the positive coincident rate was 79%(19/24). The negative results were obtained for all 31 negative control, and the negative coincident rate was 100%(31/31). Two were positive from all 30 specimens clinically suspected. Conclusions Highly specific, sensitive, repeatable and coincidental with clinic, this FQ-PCR is quite useful for rapid detection of tiny DNA of Brucella in various samples and laboratory diagnosis.     

荧光定量PCR方法应用于布鲁杆菌检测研究概述

布鲁杆菌病(简称布病)是布鲁杆菌属细菌侵入机体后引起人或动物多个器官系统发生病理损伤的人兽共患传染病.根据宿主倾向性和危害性,布鲁杆菌主要分为马耳他布鲁杆菌(B.melitensis)、流产布鲁杆菌(B.abortus)、猪布鲁杆菌(B.suis)、绵羊附睾布鲁杆菌(B.ovis)、犬布鲁杆菌(B.canis)和沙林鼠布鲁杆菌(B.neotomae)6个菌种.     

荧光定量聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌的临床应用

我们采用荧光定量聚合酶链反应 (ＦＱ ＰＣＲ)技术检测了115例结核患者高度疑有结核分支杆菌的标本和 3 0例非结核病的患者标本 ,并与培养法、抗酸染色法和ＰＣＲ 电泳法进行了比较 ,现报告如下。对象与方法　对象 :115例临床诊断为结核病的患者为四川省人民医院门诊和住院患者 ,符合结核病诊断标准。 3 0例非结核患者为对照组 ,其中肺炎 2 5例 ,慢性支气管炎 5例。标本包括痰、胸腹液、晨尿和精液。方法 :标本经处理后 ,进行碱性复红染色 ;罗氏培养基培养 ;ＰＣＲ电泳 ,每份用该法检测 2次。ＦＱ ＰＣＲ :仪器为美国ＡＢＩ公司生产的 770 0…     

实时荧光定量PCR检测直肠癌XPC基因表达

目的 检测核苷酸切除修复（NER）基因XPC在直肠癌及直肠组织中的表达。方法采用实时定量荧光PCR法,检测16例手术后切除的新鲜直肠癌组织及6例癌旁直肠组织中XPC基因表达水平。结果直肠癌中XPC基因水平明显高于正常直肠组织。结论高表达的XPC基因直接在NER早期发挥着重要作用,在一定程度上导致直肠癌患者对化疗药物的敏感性降低。     

聚合酶链反应检测布鲁杆菌的研究进展

布鲁杆菌病(简称布病)是由布鲁杆菌属引起的疾病,布鲁杆菌包括8种陆生动物种和至少2种海洋生物种.陆生动物包括羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、犬种、沙林鼠种以及田鼠型和B.inopinata 2种新种.从海洋哺乳动物分离得到的有布鲁杆菌鲸型、鳍型2种.     

基于热对流PCR技术对乳品中布鲁杆菌的检测技术研究

目的 运用热对流PCR技术检测乳品中布鲁杆菌.方法 根据布鲁杆菌保守基因序列,设计合成引物和探针,通过优化反应体系,配合商品化核酸提取试剂盒,建立检测乳品中布鲁杆菌的热对流PCR方法,并与常规荧光定量PCR方法的敏感性与特异性比较,以验证该检测方法的可靠性.结果 热对流PCR检测敏感性与常规荧光定量PCR检测敏感性基本一致,差异无统计学意义(t=85.500,P＞0.05),且该布鲁杆菌热对流PCR方法能检测出的乳品样本中布鲁杆菌含量最低浓度为10 cfu/ml;含有大肠杆菌、溶血性链球菌、克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的乳液经扩增,均为阴性结果;只有含布鲁杆菌乳液的阳性对照,经热对流PCR仪扩增后结果显示为阳性;热对流PCR方法(22.3％)与常规荧光定量PCR方法(24.1％)阳性检出率差异无统计学意义(x2=0.250,P＞0.05).结论 热对流PCR方法检测乳品中布鲁杆菌可靠性高、扩增反应时间短、方便快捷、仪器成本低廉,适用于基层现场检测病原.     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)快速检测动物布鲁杆菌的方法.方法 使用Primer 4.0,针对布鲁杆菌外膜蛋白(OMP31)基因保守区设计4条特异引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,实现DNA的梯状等温扩增,并在此方法最适扩增条件优化的基础上,对其特异性、灵敏度进行实验,同时与普通PCR灵敏度进行比较,以及进行LAMP可视化实验.结果 本研究建立的检测方法对牛种布鲁杆菌(Brucella abortus,B.abortus)544A和104M、羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)Rev-1和16M、猪种布鲁杆菌(Brucella suis,B.suis)S2和1330S、犬种布鲁杆菌(Brucellac anis,B.canis)RM6/66、绵羊附睾种布鲁杆菌(Brucela ovis,B.ovis)63/290、沙林鼠种布鲁杆菌(Brucella neotomae,B.neotomae)5K33检测阳性,而耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)O∶9、大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)O157∶H7和沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimunum)47729检测阴性.LAMP法检出最低DNA浓度为8.5×10-8 mg/L,较普通PCR检测灵敏度高.检测结果既可以通过电泳判定也可以通过可视化判定.结论 本研究所建立的布鲁杆菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁杆菌的快速检测.     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

应用多重聚合酶链式反应鉴别布鲁杆菌

目的 探讨应用多重聚合酶链式反应(Muhiple-PCR)进行布鲁杆菌株种型的鉴别.方法 以6株布鲁杆菌标准菌株(牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种布鲁杆菌标准菌株)作为阳性对照,以大肠埃希菌O∶157和小肠结肠炎耶尔森菌O∶9作为阴性对照,待测布鲁杆菌株29株.先用布鲁杆菌属特异性聚合酶链式反应(BCSP31-PCR)扩增上述待测布鲁杆菌株,扩增结果为阳性的菌株再用Muhiple-PCR方法进行布鲁杆菌种型鉴别.结果 29株待测布鲁杆菌株BCSP31-PCR方法扩增均为阳性,进一步Multiple-PCR方法扩增均为阳性,其中有20株鉴定为羊种菌,5株鉴定为猪种菌、3株鉴定为牛种菌、1株鉴定为犬种菌.结论 Multiple-PCR方法是一种快速、特异、简便、低风险的布鲁杆菌种型鉴定方法.     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

NRTIs引起的细胞线粒体DNA缺失的检测及其意义

目的应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative PCR)检测核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)司它夫定(d4T)与齐多夫定(AZT),对HepG2细胞线粒体DNA数量的影响,并探讨其意义。方法用0、3、10、100、200、300μmol/L d4T及AZT处理HepG2细胞2周,应用实时荧光定量PCR检测不同浓度药物作用后线粒体DNA的相对含量。结果成功建立线粒体DNA的定量PCR检测方法。d4T组中,药物浓度为0、3、10、100μmol/L的4个组,细胞线粒体DNA相对含量分别为(96.94±5.77)、(53.73±7.14)、(20.78±3.10)、(1.37±0.29),4个组比较差异有统计学意义(P0.01);而药物浓度为200及300μmol/L的两个组,细胞均死亡。AZT用药组中,药物浓度为0-300μmol/L的6个组,细胞线粒体DNA相对含量分别为(96.94±5.77)、(108.84±7.80)、(172.56±4.70)、(199.51±10.37)、(158.74±6.64)、(64.06±6.27),差异有统计学意义(P0.01)。结论实时荧光定量PCR检测细胞线粒体DNA方法切实可行,d4T引起细胞线粒体DNA缺失呈浓度依赖性,AZT对细胞线粒体DNA的影响表现为先增高后降低,其机制有待进一步研究。     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。     

布鲁氏菌多重荧光定量PCR方法的建立与应用北大核心CSCD

目的探讨应用多重荧光定量PCR方法检测待检者血液、血清以及环境样本中布鲁氏菌的价值。方法根据149名待测者的就诊情况进行分类,其中疑似组75人、治疗组74人。对收集的环境和待检者的样本应用多重荧光定量PCR方法检测,结果进行统计分析。将3对引物、探针的目的基因克隆到PUC57载体上制作阳性标准品,进行灵敏度检测和标准曲线的绘制。结果通过对149名待检者的样本进行荧光定量PCR检测,单重、双重和三重方法的阳性率分别为79.2%、34.2%和27.5%。单重与双重,单重与三重荧光定量方法的阳性率差异均有统计学意义,χ^(2)值分别为55.42和73.42,P<0.05。布鲁氏菌属的单重荧光定量PCR结果生成的标准曲线为y=-3.7732x+43.188,R^(2)=0.9953,线性关系良好,最低检测范围为101 copies/μL。经过多重荧光定量方法检测的环境样本结果全部为阳性。结论单重荧光定量PCR方法灵敏度较好,建议与血清学方法联合使用对高危人群进行定期筛查,三重荧光定量方法可以在一次实验中既能完成属水平的鉴定又能区分牛种和羊种布鲁氏菌,对于环境样品具有良好的扩增效果,2种方法对于布鲁氏菌病的预防控制具有重要作用。     

国产实时荧光定量PCR试剂与GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的对比分析

目的评价国产实时荧光定量PCR(FQ-PCR)试剂与GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测痰标本结核分枝杆菌的临床应用价值,并比较两者的检测效能。方法收集2017年1月至2018年12月于深圳市南山区慢性病防治院就诊的210例疑似肺结核患者的痰标本,同时做涂片镜检、BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)培养、GeneXpert和FQ-PCR检测。以MGIT 960培养为参考,比较GeneXpert和FQ-PCR检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值,比较两者与MGIT 960培养结果的一致性及两者之间的一致性。按照涂片镜检结果分级报告标准,将痰标本分为荷菌量逐步递增的6个组,即阴性组、少量组、+组、++组、+++组、++++组,比较GeneXpert和FQ-PCR检测各个组阈值循环数(Ct值)均值的差异。结果GeneXpert检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为83.7%(123/147)、87.9%(51/58)、94.6%(123/130)、68.0%(51/75);FQ-PCR检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为83.7%(123/147)、89.8%(53/59)、95.3%(123/129)、68.8%(53/77)。FQ-PCR、GeneXpert分别与MGIT 960行Kappa检验,一致性分别为85.4%(176/206)和84.9%(174/205),Kappa值分别为0.70、0.66;对GeneXpert和FQ-PCR检测结果行Kappa检验,一致性为92.8%(194/209),Kappa值为0.85。FQ-PCR检测显示,阴性组与少量组的Ct值均值比较[(33.87±5.00)和(27.29±1.30)个],差异有统计学意义(t=5.56,P<0.001);GeneXpert检测分别为(33.32±6.05)和(23.99±3.36)个,差异有统计学意义(t=5.19,P<0.001)。检测涂片阴性标本时,FQ-PCR与GeneXpert检测的Ct值均值[(33.87±5.00)和(33.32±6.05)个]差异无统计学意义(t=0.32,P=0.750);检测涂片阳性(少量组、+组、++组、+++组、++++组)标本时,FQ-PCR检测的Ct值均值[分别为(27.29±1.30)、(27.95±2.85)、(25.88±3.62)、(24.79±2.46)、(22.38±2.72)个]均明显高于GeneXpert检测[分别为(23.99±3.36)、(23.10±4.05)、(20.22±2.81)、(20.31±4.16)、(16.48±2.78)个],差异均有统计学意义(t值分别为2.60、4.71、6.08、3.85、9.02,P值分别为0.030、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001)。结论国产FQ-PCR试剂与GeneXpert检测结果一致性较好,对结核病大规模筛查、降低检测成本具有临床应用价值。     

造血干细胞移植后对人巨细胞病毒感染病毒载量的检测

目的探讨应用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）法对异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后巨细胞病毒（CMV）感染的诊断价值及对临床用药的指导意义。方法33例行allo-HSCT的患者于造血重建后，应用RQ-PCR法对其外周血CMV DNA进行动态检测，根据检测结果决定抗CMV治疗的开始、减量和终止，观察治疗效果和临床转归。结果共检出13例CMV感染患者，21次感染发作；除1次是患者中途放弃治疗外，余20次治疗中CMV DNA拷贝迅速转阴或下降至转阴，有临床表现者症状消失、器官功能恢复；且抗CMV疗程短于常规疗程。结论应用RQ—PCR法不但可以早期诊断CMV感染，及时干预治疗，还可以直观指导治疗的减量和终止、缩短疗程、减轻药物不良反应。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异的临床应用及意义

目的检测慢性乙型肝炎（CHB）患者在使用拉米夫定过程中，乙型肝炎病毒YMDD变异的发生情况并分析与YMDD变异发生的相关因素。方法110例慢性乙肝患者作为拉米夫定治疗组，30例CHB患者作为对照组。采用实时荧光PCR方法分别检测两组患者在用药期间HBV-YMDD变异的发生情况，同时检测治疗组在用药前后的HBV-DNA水平。结果治疗组在48周时的变异率为22．7％，明显高于对照组3．3％及24周时的变异率3．6％（P均〈0．05）；治疗前HBV-DNA水平较高组（47例）患者用药48周时的变异率（31．9％）明显高于HBV—DNA水平较低组（29例）患者的变异率（10．3％）（P〈0．05）；治疗组中未变异的85例患者在48周时的HBV—DNA阴转率（74．1％）明显高于变异的25例患者HBV—DNA阴转率（16．0％）（P〈0．05）。结论拉米夫定可导致HBV-YMDD变异的产生，且变异的发生率随着用药时间的延长而增加；HBV-YMDD变异的发生同HBV—DNA水平关系密切。     

荧光定量聚合酶链反应对乙型肝炎患进行个体用药疗效的评定

应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）,对50例乙肝患者连续检测血清中乙型肝炎病毒（HBV）的数量,观察临床个体用药治疗的效果。结果有41例随着治疗的进程,血清中HBV-DNA相应地逐渐减少,最后降至阴性,另有9例连续治疗半年后HBV-DNA无任何下降趋势。认为FQ-PCR可以检测HBV的真实感染和复制情况,对于乙型肝炎的临床诊断、个体用药方案的选择和疗效评价具有较大指导意义。