骨髓基质干细胞在软骨组织工程中的应用进展

自 2 0世纪 80年代美国Vicanti提出组织工程的概念以来 ,由于其广阔的应用前景和巨大的经济利益 ,以及与之密切相关的细胞生物学、分子生物学、免疫学和材料学等基础科学的快速发展 ,组织工程研究和应用得以飞速发展 ,为软骨缺损修复这个医学难题开辟了全新领域。骨髓基质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)由于其易于获得 ,能保持良好的自我更新 ,并在特定的条件下向特定组织分化的生物学特性 ,在软骨组织工程领域得到广泛的关注和应用。本文对BMSCs在软骨组织工程中的应用进展加以综述。1　BMSCs获得骨髓中主要包含造血…     

软骨组织工程支架材料的研究进展

软骨组织工程支架材料要求具有特定的生化、物理性质,如极强的生物相容性、合适的生物降解性、可控的孔径大小、足够的孔隙率等。随着软骨组织工程的发展,如何选取理想的支架材料已成为这一课题的关键。文中就近年来软骨组织工程的支架材料研究进展进行综述。     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

软骨组织工程中支架材料的研究

随着材料学、生命科学及相关学科的发展,一门新的学科正在兴起,即组织工程技术。其基本方法是:将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于具备良好生物相容性和可降解性的支架,形成细胞支架复合物,然后,将这种复合物移植到动物体内组织缺损部位,最终形成一个与机体本身在组织学及生化组成上完全相同的组织,从而完成组织缺损的修复与再造。组织工程学的中心环节是支架材料,如何在原有研究的基础上研获理想的生物活性支架,已成为组织工程这一重大课题的核心热点和难点。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

关节软骨组织工程修复的支架材料

组织工程技术是新的关节软骨缺损的修复方法，受到广泛的关注，其不同于单纯细胞移植的一个特征就是其应用了支架技术。组织工程的支架材料有着特殊的要求，前人的研究已取得一定的成果，但组织工程从实验室研究阶段到临床上的广泛应用尚需进一步的完善和改进。     

软骨组织工程生物仿生支架研究

软骨组织工程支架为软骨组织再生提供三维模板和人造细胞外基质环境,具有非常重要的作用。本文综述了现有的软骨组织工程领域中一些仿生支架的研究,包括仿生性软骨组织工程支架的特性;生物支架的制备技术;以及生物活性蛋白传递方法等。     

复合支架材料在软骨组织工程中的研究进展

用于软骨组织工程的支架材料种类众多,但尚未发现一种理想的材料可满足组织工程的需要,但将各种材料进行复合可为组织工程的需要带来新的希望.现就复合支架材料在软骨组织工程中的研究作一综述.     

软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究

目的 探讨关节软骨脱细胞基质多孔支架(CEDIS)与骨髓基质干细胞(BMSCs)体外培养组织工程软骨的可行性.方法 粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架.扫描电镜观察其微观结构,并进行组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖(GAG)、DNA含量,牛物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;分离培养犬骨髓基质干细胞,TGF-β1成软骨诱导,PKH26标记,接种到支架上体外继续诱导培养,荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d后细胞在支架内的黏附、分布情况.结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测:总胶原含量为(708.2±44.7)μg/mg,GAG含量为(254.7±25.9)μg/mg,DNA含量为(0.021±0.007)μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E=(1.226 ±0.288)MPa,覆水后压缩弹性模量E=(0.052±0.007)MPa.荧光显微镜、电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显.结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织.

Abstract：

Objective To develop a novel cartilage ECM-derived porous scaffold(cEDPs)and investigate the attachment,proliferation and distribution of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) cultured in vitro within the scaffolds.Methods Cartilage microfilaments were prepared after pulverization and gradient centrifugation and prepared into suspension after acellularization treatment.The scaffolds were examined by histological staining,scanning electron microscope(SEM),biochemical and biomechanical analysis.After labeling with PKH26,the canine BMSCs were seeded onto the scaffolds.The attachment,proliferation and differentiafion of cells were observed by inveaed fluorescent microscope and SEM.Results On histology,most extracellular matrices were retained in the scaffold after the removal of cell fragments.Safranin O staining and immunfluorescence examination with collagen Ⅱ antibodies provided positive results.Biochemical analysis showed that the collagen content was(708.2 4±44.7)μg/mg,glycosaminoglycan(254.7 ±25.9)μg/mg and DNA(0.021±0.007)μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli(E)were(1.226±0.288)and(0.052±0.007)MPa ander dry and wet conditions respectively.Inverted fluorescent microscope and SEM showed moderate cell adhesion.chondrocyte-like morphology and matrix synthesis around cells. Conclusion The CEDPS retains most extracellular matrices after a thorough decellularization so as to possess an excellent microstructure with ideal biomechanical characteristics and a good biocompatibility. Thus it is a suitable candidate as an alternative cell-carrier for cartilage tissue engineering. Chondrogenic BMSCs and CEDPS may be used to construct cartilage-like tissue in vitro.     

组织工程支架材料研究进展

细胞支架材料作为组织工程组织再生的框架,其特性直接影响细胞的粘附、生长和代谢功能,因此它是组织工程的关键要素之一。目前应用于组织工程的支架材料可分三大类：人工合成高分子可降解聚合物,天然材料提取物和细胞外基质,结合近年来的相关文献,对组织工程支架材料研究进展进行总结。     

Comparative study on seeding methods of human bone marrow stromal cells in bone tissue engineering

Background In general the traditional static seeding method has its limitation while the dynamic seeding method reveals its advantages over traditional static method. We compared static and dynamic seeding method for human bone marrow stromal cells (hBMSCs) in bone tissue engineering.Methods DNA assay was used for detecting the maximal initial seeding concentration for static seeding. Dynamic and static seeding methods were compared, when scaffolds were loaded with hBMSCs at this maximal initial cell seeding concentration. Histology and scanning electron microscope(SEM) were examined to evaluate the distribution of cells inside the constructs. Markers encoding osteogenic genes were measured by fluorescent RT-PCR. The protocol for dynamic seeding of hBMSCs was also investigated.Results DNA assay showed that the static maximal initial seeding concentration was lower than that in dynamic seeding. Histology and SEM showed even distribution and spread of cells in the dynamically seeded constructs, while their statically seeded counterparts showed cell aggregation.Fluorescent RT-PCR again showed stronger osteogenic potential of dynamically seeded constructs.Conclusion dynamic seeding of hBMSCs is a promising technique in bone tissue engineering.     

兔骨髓基质细胞组织工程骨治疗骨缺损的研究

目的 探讨应用自体骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的效果。方法 将免自体骨髓基质细胞经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增后，与胶原海绵混合培养后植于免挠骨干1．5cm缺损处。12周后处死动物，通过大体形态及x线、组织学检查进行评价。比较细胞和胶原海绵复合物移植与单纯胶原移植治疗骨缺损的疗效。结果 以组织工程骨移植于骨缺损处，骨缺损完全愈合，骨髓腔通畅。而单纯胶原移植对照组骨缺损未愈合，髓腔不通，与实验组有明显差别。结论 骨髓基质细胞是一种良好的骨源细胞，能定向分化成骨细胞，其成骨机制为膜内化骨和软骨内化骨。骨髓基质细胞作为种子细胞的组织工程骨前景乐观。     

Transfect bone marrow stromal cells with pcDNA3.1-VEGF to construct tissue engineered bone in defect repair

Background  We previously showed that nano-hydroxyapatite/carboxymethyl chitosan (n-Ha/CMCS) displayed excellent mechanical properties, good degradation rates and exceptional biocompatibility, with negligible toxicity. The aim of this study was to determine the effect of the same composite with vascular endothelial growth factor (VEGF)- transfected bone marrow stromal cells (BMSCs) in a rabbit radial defect model.

Methods  The nano-hydroxyapatite was produced through co-precipitation. The n-HA/CMCS scaffold was produced by particle filtration and lyophilization followed by genipin crosslinking. Total RNA from rabbit bone was reverse-transcribed to synthesize VEGF165-pcDNA3.1 that was transfected into the BMSCs. The composite was implanted into a rabbit radial defect model, and the osteogenic activity examined by gross morphology, X-ray examination and hematoxylin and eosin (HE) staining.

Results  The microstructure and mechanical property of the n-HA/CMCS scaffold resembled natural cancellous bone. Compared with glutaric dialdehyde crosslinked scaffolds, the genipin crosslinked scaffold was less toxic, and displayed a higher capacity to promote cell adhesion and proliferation. Spontaneous fluorescence of the composite permitted visualization of the composite-bone interface and the adhesion behavior of cells on the scaffold under laser scanning confocal microscopy. The scaffold with VEGF-transfected BMSCs bridged the bony defect and promoted healing, with most of the implanted material being replaced by natural bone over time with little residual implant. Using X-ray, we noted obvious callus formation and recanalization of the bone marrow cavity. Furthermore, HE stained sections showed new cortical bone formation.

Conclusions  The n-HA/CMCS scaffold composite with VEGF-trasnfected BMSCs is biocompatible, nontoxic, promotes the infiltration and formation of the microcirculation, and stimulates bone defect repair. Furthermore, the degradation rate of the composite matched that of growing bone. Overall, this composite material is potentially useful for bone defect repair.

     

骨髓基质细胞与玻璃陶瓷复合培养体内成骨的实验研究

目的 观察骨髓基质细胞（BMSC）与钙磷陶瓷（BGC）复合后形成骨组织的生物学机制,为形成组织工程化新生骨组织提供理论依据。方法 将BMSC与BGC复合植入动物体内后进行大体观察、组织学染色,观察其成骨过程。结果 一定浓度的BMSC与BGC复合植入动物体内可产生成熟新生骨组织,其成骨过程与局部血运、材料孔隙、孔径有关。结论 利用组织工程学方法可以形成新生骨组织,为进一步研究组织工程化新生组织的体内移植手段和方法提供了新的思路和可能。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

骨髓基质细胞的体外培养和分化诱导

目的 :建立一种简单可靠的骨髓基质细胞 (BMSc)向成骨细胞转化的体外培养方法 ,探讨骨髓基质细胞向成骨细胞转化的机理。 方法:将兔 BMSc悬液进行体外培养 ,进行形态学观察和组织学检测。 结果:传代培养细胞的碱性磷酸酶 (AL P)阳性率达 80 %以上 ,表现为成骨细胞形态并形成钙结节。结论:地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C可促进 BMSc分化为成骨细胞 ,BMSc的分化和增殖是两个对立的状态。     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

压应力对组织工程骨内人骨髓基质细胞增殖能力影响的实验研究

目的 探讨压缩应变对组织工程骨内人骨髓基质细胞(human bone mallow stromal cells,hBMSCs)增殖的作用及适合强度范围.方法 双相接种法构建组织工程骨,对其施加频率为0.5 Hz,压缩幅度分别为2%、5%、10%、15%、20%的压应力刺激hBMSCs(2 h/d).倒置显微镜观察细胞形态,扫描电镜观察培育的组织工程骨,常规病理切片和HE染色观察培育组织工程骨内细胞分布及生长情况.MTT法和流式细胞技术检测细胞增殖水平及生长周期.结果 压缩幅度为2%、5%、10%时压应力刺激可促进hBMSCs增殖;压缩幅度为15%、20%时压应力刺激抑制细胞增殖,其中以10%压缩幅度刺激细胞增殖效果最为显著,生长曲线比对照组明显前移,S期细胞百分比(27.45±0.25)%较对照组(19.15±0.26)%增高43.34%.结论 适当强度的压应力可促进hBMSCs的增殖,5%～10%的压缩幅度是促进hBMSCs增殖的适合强度.     

骨髓基质细胞与聚己内酯生物相容性的实验研究

目的:探讨骨髓基质细胞与聚己内酯 (PCL )的生物相容性 ,为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。方法 :将骨髓基质细胞与 PCL体外复合培养 ,进行形态学观察和细胞增殖、蛋白质含量及酶学测定。结果 :骨髓基质细胞能在 PCL上贴附、繁殖 ,其生长及功能不受影响 ,并且 PCL具有一定的促细胞增殖作用。结论 :PCL具有良好的生物相容性 ,有可能作为骨髓基质细胞的载体而应用于骨组织工程的研究。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点。其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞。该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考。