人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a( ),获得pET28a( )-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.     

人乳头瘤病毒58型衣壳蛋白的表达及其抗体制备

目的：构建人乳头瘤病毒58型(hpv58)衣壳蛋白L1的杆状病毒，昆虫细胞表达系统。方法：用杆状病毒，昆虫细胞表达系统大量表达HPV58L1蛋白，并用HPV58L1病毒相似颗粒(VLP)免疫BALB／c小鼠制备特异性抗血清。结果：HPV58L1蛋白在SF9细胞中被高效表达，其相对分子质量为55kD；CsCI超速离心结合蔗糖密度超速离心可纯化此蛋白。在电镜下可见纯化的病毒衣壳蛋白L1形成VLP。用其免疫小鼠制备的相应抗体能与HPV58L1特异性结合。结论：成功表达了HPV58衣壳蛋白L1，并制备出高滴度的抗体。     

悬浮培养昆虫细胞表达重组HPV16 L1蛋白

目的 用悬浮培养昆虫细胞方式表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白,为获得病毒样颗粒(VLPs)及进一步深入研究疫苗和诊断试剂盒打基础.方法 优化昆虫细胞Sf9的悬浮培养条件;优化扩增病毒和蛋白的条件;空斑试验测定病毒滴度;SDS-PAGE和Western Blot分析目的蛋白的表达情况;透射电镜观察细胞内HPV16 L1蛋白形成的VLPs.结果 优化后,悬浮培养昆虫细胞初始接种密度为5×105cell/ml,以MOI(Multiplicity ofInfection)=10接种重组病毒rBacV/HPV16 L1,72～84h收获细胞沉淀为最佳.经透射电镜观察,在重组病毒感染的昆虫细胞内,存在HPV16L1蛋白形成的VLPs.结论 优化了细胞悬浮培养、病毒扩增和蛋白表达的条件;电镜观察在重组病毒rBacV/HPV16L1感染的昆虫细胞中,HPV16 L1蛋白可形成VLPs.     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1的表达及病毒样颗粒的装配

目的　在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )哈尔滨地区分离株的晚期蛋白L1,并分离纯化由L1蛋白在细胞中自主组装成的病毒样颗粒 ,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。方法　获得含有HPV16L1基因的重组杆状病毒并使目的蛋白L1在昆虫细胞中表达 ;对重组杆状病毒的扩增条件及L1蛋白的表达水平进行优化 ;电镜下观察昆虫细胞中晚期蛋白装配成病毒样颗粒的情况 ,经氯化铯密度梯度纯化病毒样颗粒 ,并经Westernblot进行验证。结果　获得了稳定表达L1蛋白的重组杆状病毒 ;以MOI值为 0 .2感染昆虫细胞可获得较高滴度的重组病毒 ,以MOI值为 10感染昆虫细胞可获得较高水平的L1蛋白表达 ;电镜下可观察到昆虫细胞核内直径为 5 5nm的病毒样颗粒 ;病毒样颗粒可通过氯化铯密度梯度离心获得。结论　获得人乳头瘤病毒哈尔滨地区分离株L1蛋白可在昆虫细胞中自主装配的病毒样颗粒并成功分离纯化。     

HPV16L1晚期蛋白的鉴定及电镜观察的研究

目的：通过对HPV16L1晚期蛋白的鉴定及电镜观察，为制备宫颈癌预防性疫苗奠定基础。方法：采用Western blot方法对所表达蛋白进行特异性鉴定，并利用透射电镜观察HPVI16 L1在酵母菌中自我组装成的病毒样颗粒（VLPs0。结果：所表达的外源蛋白能与鼠抗HPVI6 L1单克隆抗体特异结合，证明该蛋白确为HPVI6 L1基因编码，电镜下观察到了HPVI6 L1的VLPs。结论：HPVI6 L1基因经诱导可表达HPVI6 L1晚期蛋白，该蛋白可自我组装成VLPs。     

人乳头瘤病毒16型中国株L1基因的体外真核表达

目的 构建人类乳头瘤病毒16型(HPV16)中国株晚期基因L1的真核表达系统.方法 将HPV16中国株L1基因从pCR2.1/HPV16L1定向亚克隆至pTacer-CMV载体,构建重组质粒pTaeer-CMV/HPV16L1,将重组质粒用脂质体转染N1H3T3、HeLa细胞,用透射电镜、SDS-PAGE、蛋白印迹等方法观察HPV16 L1蛋白的表达.结果 NIH3T3、HeLa细胞经pTacer-CMV/HPV16L1转染后,SDS-PAGE、蛋白印迹等实验显示可表达HPV16 L1蛋白,电镜下可见病毒样颗粒(VLP).结论 pTacer-CMV/HPV16L1构建成功,可在体外表达HPV16中国株L1蛋白.     

HPV 18 L1病毒样颗粒的表达纯化及其豚鼠抗血清制备

目的 优化人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期基因L1并在昆虫细胞中表达,获得HPV 18 L1病毒样颗粒(VLP),制备豚鼠抗血清。方法 联合利用昆虫细胞偏性密码子、C末端截短32个氨基酸、降低mRNA二级结构等策略优化HPV 18 L1基因,合成后克隆入pFastBac1载体,构建重组病毒,感染sf9昆虫细胞72h后进行Western blot表达鉴定,密度梯度离心法纯化后进行纯度鉴定及形态学鉴定,获得HPV 18 L1 VLP,联合弗氏佐剂免疫豚鼠制备抗血清。结果 HPV 18 L1优化基因在昆虫细胞中可有效表达,纯化的HPV 18 L1蛋白纯度达90%以上,电镜观察可见直径约为50nm的VLP,豚鼠免疫血清中HPV 18 L1 VLP 特异性抗体滴度达5.12×105。结论 HPV 18 L1优化基因可在昆虫细胞中高效表达并组装成VLP,制备的高滴度抗血清为HPV 18 L1 VLP疫苗的进一步研究打下基础。     

人乳头瘤病毒16型野毒株L1-E7融合基因重组腺病毒载体构建及在293细胞中表达嵌合病毒样颗粒的研究

目的制备人乳头瘤病毒HPV16L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗。方法以HPV16型的野毒株HPV16-114/K为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16L1-E7融合基因pUC19L1-E7,含L1的1～301氨基酸（AA）和E7的1～60AA的编码DNA序列;并转入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHG10共转染293细胞,筛选重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7。以PCR、ELISA和Westernblot方法鉴定重组病毒及其表达的L1-E7蛋白,密度梯度超速离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP,电镜观察VLP的形态结构。结果PCR-DNA序列分析表明成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7;并获得HPV16重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,在293细胞中可高效表达L1-E7蛋白,并形成嵌合病毒样颗粒（cVLP）。结论构建的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7可有效表达HPV16L1-E7cVLP,可进一步用于动物实验,研究其在防治宫颈癌中的作用。     

人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌 …

目的　研究人乳头状瘤病毒(HPV)主要结构蛋白L1(HPV16L1)和次要结构蛋白L2(HPV16L2)在原核系统的表达。方法　采用pET30a载体分别构建pET30aL1和pET30aL2质粒,并分别转入大肠埃希菌BL21菌株,经IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导,表达融合蛋白6×HisL1和6×HisL2,用SDSPAGE和Westernblot方法进行检测。结果　6×HisL1和6×HisL2融合蛋白在BL21菌中高效表达,约2～3mgml,其相对分子质量分别约为60000和97000;6×HisL1降解较6×HisL2多。结论　HPV16结构蛋白L1和L2能在原核表达系统高效表达;6×HisL2稳定性高于6×HisL1融合蛋白。     

HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1，并鉴定其免疫反应性。方法：将HPV-16L1基因克隆人原核表达载体pThioHisC中，构建重组表达载体。以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α，在IPTG诱导下表达外源基因，用SDS—PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果：构建了HPV—16L1基因的原核表达质粒pThioHisC／HPV—16L1，并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70800的蛋白。表达的蛋白能与抗HPV—16L1抗体发生特异性反应。结论：在原核细胞中成功地表达HPV—16L1基因，为HPV—16L1疫苗的研制提供了必要的基础。     

人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对CaMKKβ、AMPK药物研发提供科研基础。方法克隆人CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用Glo?Max Assay方法检测其活性。结果通过基因测序表明pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人CaMKKβ蛋白在CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。结论成功构建原核表达载体pET28a-CaMKKβ,实现重组人CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的CaMKKβ自主酶活性较强,受CaM/Ca2+影响较小。     

嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的扩增编码Ⅳ型菌毛蛋白的嗜肺军团菌pilE基因,构建重组质粒pET32a（＋）-pilE并在原核系统中表达．纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE．为进一步探讨Ⅳ型菌毛蛋白的作用及其作为军团病的诊断抗原提供实验基础。方法采用聚合酶链式反应（PCR）从嗜肺军团菌扩增得到pilE基因,构建重组质粒pET32a（＋）-pilE,转化大肠杆菌BL21（DE3）并用聚合酶链式反应、限制性酶切分析、序列分析鉴定后,IPTG诱导表达PIIJE蛋白,用硫酸十二烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）、Western印迹鉴定。使用HisTrap^TM HP亲和层析柱纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。结果扩增出430bp的pilE基因;构建了重组质粒pET32a（＋）-pilE;表达并纯化出35700Mr的目标蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的原核重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。成功纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。     

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板，PCR扩增L1的片段，L1片段经EcoRI和SalⅠ双酶切后，插入载体pGEX4T-1，转化JM109感受态细胞，平板筛选获得pGEX4T-1／HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T-1／HPV16L1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T-1／HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的诱导人腺苷激酶重组蛋白在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a（＋）连接构建的重组蛋白表达载体pET30a（＋）／ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞。1mmol／L的1PTG诱导重组蛋白表达。离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体。用含2mol／L和4mol／L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白。随后用含8mol／L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀。用Ni—NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8mol／L尿素的洗脱缓冲液洗脱。收集样品透析复性。结果成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85％以上的重组蛋白。结论人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化,为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒6b L1/16E7嵌合蛋白的基因克隆和表达

目的 研究HPV6bL1/16E7嵌合蛋白的基因克隆及其在昆虫细胞的表达,为防治尖锐湿疣和宫颈癌的基因工程疫苗研究作准备。方法 用PCR扩增出HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达HPV6bL1/16E7嵌合蛋白。结果 HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因在昆虫细胞中得到了表达,并可自组装形成病毒样颗粒。结果 昆虫细胞表达的HPV6bL1/16E7嵌合病毒样颗粒可进一步用于HPV感染的免疫机理及基因工程疫苗研究。     

GPS2的表达纯化以及抗体的产生

目的 旨在克隆表达纯化GPS2蛋白,并制备抗血清用于研究GPS2的功能.方法 用RTPCR得到GPS2基因,并克隆到pET-28a原核表达载体,用Ni2+-NTA树脂纯化GPS2后,免疫兔得到抗血清.结果成功构建了pET-28a-GPS2原核表达质粒,并实现重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达,Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化了GPS2蛋白,经过透析复性后得到质量浓度约为300μg/ml的GPS2纯化蛋白;制备了GPS2蛋白的特异性多克隆抗血清,ELISA测定抗血清效价远远高于1:12 800,Western Blot表明该抗血清能够特异性识别结合GPS2蛋白.结论 GPS2在E.coli高效表达,其纯化产物可用于制备抗血清,用于GPS2的功能分析.     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT—PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX—1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blowing对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。