DNA-PKcs反义寡核苷酸对不同p53功能状态的鼻咽癌细胞株辐射抗性的影响

背景与目的:DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是一种双链断裂修复蛋白,可以修复细胞的DNA双链断裂损伤。本研究通过转染DNA-PKcs反义寡核苷酸入鼻咽癌细胞株,探讨DNA-PKcs反义寡核苷酸对不同p53功能状态的鼻咽癌细胞株的放射敏感性的影响。方法:利用LipofectamineTM2000转染DNA-PKcs反义寡核苷酸入鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-1-wtp53;设0、0.5、1、2、4、6、8Gy7个放射剂量点,用集落形成法分析转染反义寡核苷酸前后细胞的存活情况,并分别用线性二次模型和单击多靶模型拟合出细胞的剂量存活曲线,求出放射生物学参数α、β、α/β、SF2、D0、Dq和N值,评价细胞放射敏感性的变化。结果:转染DNA-PKcs反义寡核苷酸前,CNE-1和CNE-1-wtp53的α值分别为0.03、0.05,SF2值分别为0.73、0.50,D0值分别为2.08Gy、1.13Gy,Dq值分别为2.04Gy、1.36Gy。转染DNA-PKcs反义寡核苷酸后,CNE-1和CNE-1-wtp53的α值分别为0.04、0.26,SF2值分别为0.45、0.21,D0值分别为1.07Gy、0.83Gy,Dq值分别为1.24Gy、0.73Gy。转染DNA-PKcs反义寡核苷酸后,鼻咽癌细胞的α值增大,SF2、D0、Dq值均减小。结论:DNA-PKcs反义寡核苷酸可逆转CNE-1的辐射抗性,该逆转作用不依赖细胞的p53功能状态。     

中性彗星分析法检测肿瘤细胞的放射敏感性

[目的]研究中性彗星分析法检测肿瘤细胞内在放射敏感性的可靠性和影响因素.[方法]人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE-1和人纤维肉瘤细胞株HT1080细胞,用6MV X线以0、100、200、300、400、600、800、1000cGy等不同剂量点照射,克隆形成法制定存活曲线,比较其放射敏感性的差异.然后进行两种细胞于600cGy照射后1、2、4、8h的中性彗星分析,以尾力矩为指标,动态检测不同时间点残留的DNA双链断裂,并与克隆形成分析结果相比较.[结果]克隆形成分析法显示CNE-1细胞的放射敏感性低于HT1080细胞,其2Gy照射后存活分数(SF2)和平均致死剂量D0值分别为0.397、0.331和1.898、1.287.两种细胞在照射后1、2、4h的中性彗星尾力矩分别为0.148±0.106、0.100±0.083、0.058±0.043和0.297±0.179、0.157±0.092、0.092±0.060,各时间点之间有显著性差异(P＜0.05),但差别逐渐减小;照射后2h和4h的尾力矩比值分别为0.637和0.630,与SF2比值和D0比值的倒数(0.834和0.678)较接近;两种细胞照射后8h的尾力矩比较差异无显著性.[结论]中性彗星分析法与克隆形成分析法的检测结果有确切的相关性,照射后一定时间内的残留DNA双链断裂有可能成为检测肿瘤细胞放射敏感性的指标.     

薏苡仁酯对人鼻咽癌细胞辐射效应的协同作用

 目的 探讨薏苡仁酯(coixenolide,CXL)对人鼻咽癌细胞CNE-2Z辐射效应的影响.方法 以60Co为放射源,采用微量细胞克隆形成法检测CNE-2Z对γ射线的敏感性.结果 CXL使CNE-2Z的辐射-存活曲线向左移,Do、Dq和N值下降.不同浓度的CXL(5-20 μmol/L)使放射剂量减少17.26%-41.90%(在D37水平),其增效比(ER):Do比值1.14-1.64,Dq比值1.27-1.79.另外,CXL和射线的合并效应大于两者单独效应之和.结论 CXL和射线的相互作用产生协同效应.     

转染p16基因对人肺腺癌细胞放射效应的影响

目的 :探讨p16基因与人肺腺癌细胞放射效应的关系。方法 :免疫组化、Westernblot方法检测人肺腺癌细胞株Anip973、AGZY83a的p16蛋白表达 ,FuGene转染方法把 p16表达载体转入这两个细胞株 ,进行细胞存活曲线、流式细胞仪 (FCM )分析细胞周期分布。结果 :p16蛋白表达AGZY83a为 87.4 % ,明显高于Anip973(5 2 % ) ,细胞存活曲线显示低表达的Anip973与转染后Anip973p16的Dq值有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,D0 值间无显著差异 (P >0 .0 5 )。p16蛋白高表达的AGZY83a与AGZY83ap16间D0 值、Dq值均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;流式细胞仪测定细胞周期结果显示 ,Anip973转染 p16基因后出现G2 M期比例增加 ,S期比例减少。结论 :转染 p16基因后可能通过改变细胞周期分布及抑制细胞对照射后的亚致死性损伤修复 ,来改变p16蛋白低表达的人肺腺癌细胞株Anip973的放射效应 ,而对于高表达的AGZY83a则无显著影响。     

UCN-01增加鼻咽癌细胞放射敏感性的相关机制

目的 在前期研究基础上，进一步探讨UCN-01增加鼻咽癌细胞放射敏感性的相关机制。方法 应用流式细胞仪和凋亡试剂盒测定不同条件下CNE-1细胞的凋亡比例。应用彗星分析法测定不同实验组肿瘤细胞在照射后不同时间的DNA损伤程度，用以观察UCN-01对CNE-1细胞修复DNA损伤能力的影响。结果 照射＋UCN-01组与单纯照射组相比，细胞总凋亡比例仅有轻微增加（14．9％：13．6％），其中主要表现为早期凋亡比例轻度增加（5．0％：3．9％），两组细胞晚期凋亡比例相仿（9．9％：9．7％），细胞凋亡不是UCN-01对CNE-1细胞放射增敏的主要机制。照射后加入UCN-01组细胞的尾力矩下降速度较单纯照射组明显降低，即DNA的修复速度降低，两组的半修复时间分别为3．1、0．4h，说明UCN-01使CNE-1细胞修复放射性DNA损伤的能力下降。结论 UCN-01未明显增加放射后CNE-1细胞的凋亡比例；UCN-01使细胞修复放射性DNA损伤的能力降低可能是该药放射增敏的重要机制之一。     

碱性"彗星"法检测肺癌初始放射损伤与临床疗效的相关性

背景与目的肺癌细胞具有显著的生物学异质性和内在放射敏感性差异，探求其放射敏感性相关参数以优化治疗计划是亟待解决的问题。“彗星”分析法（cometassay）可以通过荧光显微镜直接定量地检测单个细胞的DNA损伤。具有需要细胞数少、灵敏和快速的优点。临床前的相关研究显示：彗星分析法与经典的克隆形成率分析的结果趋势一致，是一种有潜力的放射敏感性分析法。本研究旨在用碱性彗星法检测31例放射治疗肺癌标本的初始DNA损伤，初步探讨其与疗效的相关性。方法2002年4月至2002年11月，用碱性彗星法检测31例接受放射治疗的肺癌病例在治疗前经支气管镜活检标本的初始DNA损伤，以经本底较正的平均尾力矩（RTM）为评价指标，同时以胸部CT扫描评价局部肿瘤反应率（RR）和肿瘤进展时间（TTP）；用SPSS10．0统计软件以曼-惠特尼U检验和克鲁斯-沃里斯H检验比较不同病理类型、RR和TTP组的中位RTM；计算RTM与RR和TTP的斯皮尔曼等级相关系数。结果不同病理类型组、RR≥50％组和TTP〉9个月组中位RTM与对应组相应值间比较均无统计学差异（χ^2=0．347，P=0．84；U=63．5，P=0．57；U=71，P=0．057）；RTM与RR和TTP的斯皮尔曼相关系数分别为-0．105（P=0．57）和0．38（P=0．035）；非小细胞肺癌的RTM与TTP斯皮尔曼相关系数为0．47（P=0．048），而小细胞肺癌为0．043（P=0．89）。结论尽管受取材质量和混杂因素致本底DNA损伤高的影响，碱性彗星法检测的肺癌初始放射损伤（RTM）仍可显示出与非小细胞肺癌局部TTP具有中等强度的正相关性，“彗星”分析法是一种有希望的肺癌细胞放射敏感性分析法，其取材和实验方法有待改进。     

热疗与化疗对放射存活曲线影响的实验研究

目的 :通过细胞学实验方法 ,观察加温与羟基喜树碱 (HCPT)对人肺腺癌Anip973细胞放射存活曲线的影响 ,以期为提高肿瘤治疗效果提供更科学的方法。方法 :采用细胞集落形成方法 ,得出加温与羟基喜树碱 (浓度为 0 5 μg mL)单独或联合与放射作用下的细胞存活曲线 ,并通过对各组曲线特征参数的分析来观察放射敏感性的变化。结果 :单放、加温与放射、HCPT与放射、加温与HCPT并用放射各组的Do、Dq、N、SF2 、β值逐渐减小 ,K、α、α β值逐渐增大。结论 :加温与羟基喜树碱均能增加Anip973细胞的放射敏感性 ,使细胞修复亚致死性损伤的能力减弱 ,直接杀伤效应增加 ,且HCPT作用强于加温 ,而二者联合则效果更佳     

热疗与化疗对放射存活曲线影响的实验研究

目的：通过细胞学实验方法，观察加温与羟基喜树碱(HCPT)对人肺腺癌Anip973细胞放射存活曲线的影响，以期为提高肿瘤治疗效果提供更科学的方法。方法：采用细胞集落形成方法，得出加温与羟基喜树碱(浓度为0．5μg/mL)单独或联合与放射作用下的细胞存活曲线，并通过对各组曲线特征参数的分析来观察放射敏感性的变化。结果：单放、加温与放射、HCPT与放射、加温与HCPT并用放射各组的Do、Dq、N、SF2、β值逐渐减小，K、α、α/β值逐渐增大。结论：加温与羟基喜树碱均能增加Anip973细胞的放射敏感性，使细胞修复亚致死性损伤的能力减弱，直接杀伤效应增加，且HCPT作用强于加温，而二者联合则效果更佳。     

“彗星”分析法检测鼻咽癌细胞DNA放射损伤与修复

目的　探讨“彗星”分析法(CometAssay)检测鼻咽癌细胞DNA放射与修复反应的可能性。　方法　采用碱性“彗星”分析法的微胶电泳技术,定量检测评价人高、低分化鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z细胞在接受X射线照射后,其DNA单链断裂(SingleStrandBreaks,SSBs)的程度,及其与放射剂量的关系和DNA的SSBs在不同检测时间的自身修复情况。　结果　用碱性“彗星”分析法可准确地检测出2Gy单一放射剂量所诱导的两系细胞DNA的SSBs;可见DNA损伤程度在不同照射剂量其结果不同,随剂量递增DNA的损伤加重,与放射剂量呈良好线性相关。15Gy诱导两系细胞的DNA损伤后,10min即可定量检测出受损DNA的确切恢复变化,在照射30min内,其修复较迅速,其损伤程度可降至初时的一半以下,其后修复缓慢,约需持续2h才能复至无照射细胞水平。　结论　“彗星”分析法检测结果能准确反映人鼻咽癌细胞DNA的定量损伤程度及其与放射剂量的关系,以及损伤后自身修复能力在受测时间中的定量变化情况     

DNA-PKcs 表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

 目的 探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1（鼻咽高分化鳞癌细胞株）和CNE-2（鼻咽低分化鳞癌细胞株）中DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）的催化亚基DNA-PKCS基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法 通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β,SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RTrFQPCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平DNA-PKCS基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2．78、1．61，SF2值分别为0．627、0．341；4Gy照射后12h的存活率分别为88．2％、72．3％；RT-FQPCR显示两株细胞中均有DNA-PKCS基因的表达，其相对表达量之比为7．54±2．71（t=4．17，P=0．014），表达差异有统计学意义，DNA-PKCS基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论实验验证了CNB2比CNE-1对射线更敏感，DNA-PKCS基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。     

“彗星” 法分析人肿瘤细胞DNA放射损伤和修复

探讨“彗星”分析法 (CA)在检测体外培养人肿瘤细胞DNA放射损伤与修复和放射敏感性的关系。方法　采用碱性CA检测鼻咽高分化鳞癌上皮细胞系 (CNE 1)、食管鳞癌上皮细胞系 (Ec 10 9)、肺腺癌细胞系 (GLC)和胃低分化腺癌细胞系 (BGC 82 3)经 6MVX射线照射后单细胞内DNA单链断裂 (SSB)程度及其与放射剂量的关系 ,以及CNE 1和GLC细胞系在分别接受了 16GyX射线照射后的自身修复情况 ,同时与相应的细胞存活曲线比较。结果　碱性CA可以检测出 4个细胞系DNA的SSB ,并与放射剂量呈良好的线性关系。 16Gy剂量下各细胞系的SSB程度依次为CNE 1>Ec 10 9>GLC >BGC 82 3。CNE 1,Ec 10 9,GLC和BGC 82 3细胞系的Do值分别为 1.2 5 ,1.2 7,1.88和 1.5 6。 16Gy诱导CNE 1和GLC细胞系的DNA损伤后 ,其半修复时间分别为 7.4,17.8min。结论　采用碱性CA能确切反映 4种人肿瘤细胞系DNA的定量损伤程度及其与放射剂量的关系 ,并能确切反映辐射损伤后自身修复能力 (CNE 1和GLC)在受测时间中的定量变化情况。自身修复能力的大小在鳞癌和腺癌细胞系间与放射敏感性的大小 (Do值 )有较好的对应关系。     

中性单细胞凝胶电泳测定DNA双链断裂

目的 :检测人类肿瘤细胞系统经 X线照射产生的 DNA双链断裂 (DSB)及其修复过程 ,初步验证双链断裂及其修复与细胞放射敏感性的关系。材料与方法 :采用中性单细胞凝胶电泳定量测定 DSB的实验方法 ("彗星 "法 ) ,测定了细胞 SF2差异较大的 He La和 GL C细胞的 DSB及 DSB修复动力学过程。结果 :不同剂量 X线照射引起的细胞 DSB呈显著的线性关系 ,与细胞 SF2不存在相关性 ,但其修复与 SF2具有一定相关性。结论 :X线导致细胞 DSB的修复能力比 DSB初始断裂数更能反映细胞的放射敏感性     

Relationship between clonogenic radiosensitivity, radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells

The intrinsic radiation sensitivity of normal and tumour tissue is a major determinant of the outcome of radiotherapy. There is currently no established test that can be used routinely to measure the radiosensitivity of the cells in an individual patient's cancer in a manner that can inform treatment planning. The purpose of this study was to evaluate, in four human colorectal adenocarcinoma cell lines, two possible end points as surrogate markers of radiation response--apoptosis and induction of DNA single-strand breaks--and to compare the results with those of a conventional clonogenic assay. Cell lines (SW707 SW480, SW48 and HT29) known to differ in radiosensitivity were exposed to single doses of X-rays ranging from 0.5 to 5 Gy and cell survival was measured using the clonogenic assay. Apoptosis was determined on the basis of morphology under fluorescent microscopy and DNA damage/repair was measured, as tail moment, using an adaptation of the alkaline comet assay. The relationship between surviving fraction at 2 Gy (SF2) and the percentage of apoptotic cells 24 h after the same dose was complex, but apoptosis accurately predicted the order of radiosensitivities as measured by SF2. Initial damage measured after 2 Gy using the alkaline comet assay gave a close correlation with SF2 (r2=0.95), whereas there was no correlation between initial DNA damage repair rate and SF2.     

Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity

In the UK, the two main treatments of invasive bladder cancer are radiotherapy or cystectomy. However, approximately 50% of patients undergoing radiotherapy fail to respond. If tumour radiosensitivity could be predicted in advance, it may be possible to improve control rates significantly by selecting for radiotherapy those patients whose tumours are radiosensitive. Additionally, patients who would benefit from surgery would be identified earlier. The alkaline comet assay (ACA) is a sensitive method for the detection of DNA strand break damage in cells. In the present study, using six bladder cancer cell lines of differing radiosensitivities, cell survival was compared to the manifestation of radiogenic DNA damage as assessed by ACA. For all the cell lines, the extent of comet formation strongly correlates with cell killing (R2>0.96), with a greater response being noted in radiosensitive cells. In repair studies, measures of residual damage correlate with survival fraction at 2 Gy (R2>0.96), but for only five of the cell lines. Finally, cells from human bladder tumour biopsies reveal a wide range of predicted radiosensitivies as determined by ACA. Overall, these studies demonstrate ACA to be a good predictive measure of bladder cancer cell radiosensitivity at low dose, with potential clinical application.     

甘草素通过影响鼻咽癌CNE-2 细胞的自噬增强其放疗敏感性

[摘要] 目的：探讨甘草素（licorice）对鼻咽癌CNE-2 细胞放疗增敏的影响及其作用机制。方法：体外培养构建放射抵抗性的鼻咽癌细胞株CNE-2-RR。MTT细胞实验检测不同浓度的甘草素对鼻咽癌细胞增殖活性的影响,透射电镜检测甘草素处理鼻咽癌细胞后自噬体的变化情况,Western blotting 检测甘草素对鼻咽癌细胞自噬蛋白水平的影响,彗星实验检测不同组鼻咽癌细胞DNA损伤修复情况,流式细胞术检测鼻咽癌细胞株凋亡率的变化。结果：成功构建放射抵抗细胞株CNE-2-RR,20 mmol/L甘草素对鼻咽癌细胞的最高抑制率为（58.86±5.02）%。甘草素处理鼻咽癌CNE-2-RR细胞后胞内自噬体数量增加,线粒体和细胞核形态异常;细胞中自噬体蛋白LC3-II 水平升高、LC3-I 水平降低（P<0.05）;甘草素作用CNE-2-RR细胞后彗星尾距长度大于对照组,表明对DNA损伤修复能力明显降低。甘草素作用导致CNE-2-RR细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）。结论：甘草素通过影响鼻咽癌CNE-2-RR细胞的自噬行为及DNA修复能力增强其对放疗的敏感性。     

抑制Polo样激酶1对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响

目的:探索抑制Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞CNE-1和CNE-2辐射敏感性的影响.方法:分别运用siRNA和小分子抑制剂BI2536抑制CNE-1和CNE-2细胞内PLK1的表达或磷酸化,通过MTT法检测抑制PLK1对NPC细胞增殖能力的影响,流式细胞技术检测对细胞周期和凋亡的影响,细胞免疫荧光检测对辐射后DNA损伤位点的影响,克隆形成实验及曲线拟合计算对辐射后细胞放射生物参数和放射增敏比(sensitizationenhancement ratio,SER)的影响.结果:与对照组相比,抑制PLK1可以明显抑制NPC细胞增殖,并诱导细胞发生G2-M期阻滞和有丝分裂灾难.抑制NPC细胞PLK1联合射线辐射后,NPC细胞克隆形成能力下降(CNE-1:P ＜0.05;CNE-2:P ＜0.05),且随着BI2536浓度的增大克隆形成能力下降更加明显(CNE-1:P ＜0.05;CNE-2:P ＜0.05);细胞生存分数明显降低(均P＜0.05);核中γ-H2AX位点数目明显增加(P＜0.05);细胞凋亡率显著升高(均P＜0.05);siR-PLK1转染CNE-1和CNE-2后SER分别为1.1988和1.3198,BI2536处理CNE-1和CNE-2后SER分别为1.5508和1.2028.结论:抑制PLK1可以抑制NPC细胞增殖,诱导发生细胞周期阻滞和有丝分裂灾难,并能显著提高NPC细胞辐射敏感性.     

Potential use of the alkaline comet assay as a predictor of bladder tumour response to radiation

Bladder tumours show a variable response to radiotherapy with only about 50% showing good local control; currently there is no test to predict outcome prior to treatment. We have used five bladder tumour cell lines (T24, UM-UC-3, TCC-SUP, RT112, HT1376) to investigate the potential of the alkaline comet assay (ACA) to predict radiosensitivity. Radiation-induced DNA damage and repair were compared to clonogenic survival. When the five cell lines were irradiated and initial DNA damage was plotted against cell survival, at all doses (0-6 Gy), a significant correlation was found (r2=0.9514). Following 4 Gy X-irradiation, all cell lines, except T24, showed a correlation between SF2 vs half-time for repair and SF2 vs residual damage at 5, 10, 20 and 30 min. The T24 cell line showed radioresistance at low doses (0-2 Gy) and radiosensitivity at higher doses (4-6 Gy) using both cell survival and ACA end points, explaining the lack of correlation observed for this cell line. These data indicate that initial DNA damage and residual damage can be used to predict for radiosensitivity. Our data suggest that predictive tests of radiosensitivity, appropriate to the clinical situation, may require the use of test doses in the clinical range.