人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定

构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121Ⅱ的重组原核表达质粒,获得hVEGF121Ⅱ蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术,在已构建的hVEGF121Ⅰ突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407-426两段串联重复序列的编码基因,PCR产物经Hind III和Nco I双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,乳糖诱导表达,超声破碎菌体,包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ,Western-blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121Ⅱ蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121Ⅱ,重组菌株经乳糖诱导后,目的蛋白表达量占全菌蛋白的62%,分离纯化后纯度达到95%,hVEGF121Ⅱ蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVEGF121Ⅱ蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。     

重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：构建噬菌体β‐GT蛋白的原核重组体系,诱导表达、纯化GST‐β‐GT 融合蛋白并对其进行酶活性测定。方法利用PCR技术从T4噬菌体中扩增β‐GT基因;经T‐A克隆,获得β‐GT基因片段,经酶切连接,构建原核表达载体pGEX‐6P‐1‐β‐GT ;经测序鉴定序列正确后,将所构建的载体转化进入大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达。利用IPTG诱导,经10％ SDS‐PAGE鉴定目的蛋白表达后,采用GST柱纯化目的蛋白;通过酶切和qPCR鉴定其活性。结果成功扩增了噬菌体β‐GT基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达出GST‐β‐GT融合蛋白;通过GST柱纯化后获得了GST‐β‐GT融合蛋白,纯度达95％;通过酶切和qPCR验证,此GST‐β‐GT融合蛋白具有T4‐β‐GT酶的活性。结论。原核表达GST‐β‐GT融合蛋白具有糖基转移酶活性。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人纤溶酶原K5基因的结构改造及其在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的 改造人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因,构建RGDRGD-liteK5融合表达质粒,并表达纯化所得RGDRGD-liteK5蛋白.方法 以入纤溶酶原K5 cDNA为模板,通过PCR得到RGDRGD-liteK5基因片段,并克隆到质粒pGEXl-λT中,构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5;在IPTG诱导下,观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况;利用亲合层析柱纯化表达产物,用Western blot分析鉴定表达产物.结果 PCR扩增得到274 bp的片段,并成功插入pGEX1-λT质粒;含重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,其分子量为36 kD;获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量约为10 kD的RGDRGD-liteK5蛋白;Western blot证实了表达产物的正确性.结论 成功地改造了人纤溶酶原K5基因,构建了重组融合表达质粒pGEX-RGDRGD-liteK5,并纯化了其表达产物.     

重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

目的　研究重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达 ,并进行纯化和活性的测定。方法　将已构建成功的小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,产物依次进行DE 5 2、P11磷酸纤维素和肝素 Sepharose柱层析分离 ,SDS PAGE银染。结果　重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量为 4 2ku蛋白过度表达 ,表达蛋白约占菌体总蛋白的 30 6 %。从2 87mg可溶性蛋白质中得到 4 7mg纯化蛋白。SDS PAGE银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带。纯化的CK2α和 β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶。重组的CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致。结论　重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2α亚基     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

乳糖诱导重组人SOD基因在大肠杆菌中的表达

利用乳糖代替IPTG诱导rhCu/Zn-SOD在大肠杆菌(Escherichia coli）BL21（DE3）中的表达,并将菌体生长情况及产物表达规律与IPTG诱导进行比较。对诱导所需的乳糖浓度、金属离子浓度等因素进行了研究,并分析了低温下诱导对重组蛋白表达的影响。最终在摇瓶发酵条件的基础上,实现了乳糖诱导重组菌的5L全自动发酵罐培养,rhCu/Zn-SOD酶活性达到1810U/ml(发酵液）。结果表明,乳糖可以诱导rhCu/Zn-SOD在Escherichia coli中的表达,并且酶活性达到IPTG诱导时的89%。     

催化合成谷胱甘肽的基因工程菌的构建及表达

目的利用基因工程菌合成谷胱甘肽。方法克隆γ-谷氨酰转肽酶,构建重组质粒pET30a-GGT,乳糖诱导融合蛋白的表达,利用pET30a-GGT/E.coliBL21和pET32a-GSH-II/E.coliBL21分两步法合成γ-谷氨酰半胱氨酸与谷胱甘肽。结果工程菌的最佳乳糖诱导条件为:浓度3mmoL.L-1、时间6h、温度28℃。工程菌经最佳条件诱导后,γ-谷氨酰转肽酶的酶活大约是出发菌株E.coliDH5α的21倍,酶活力得到明显提高,谷胱甘肽的产量达到0.524g.L-1。结论成功地为今后利用基因工程菌催化合成谷胱甘肽寻找到一种新的方法 。     

乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达

目的以含有人源性胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因的大肠杆菌DH5a为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时目的融合蛋白的表达规律。方法利用可表达hIGF-1的工程菌,研究乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌在不同条件下表达目的蛋白的一般规律．并优化表达条件,表达结果借助SDS-PAGE等方法进行分析。结果乳糖可诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达．最优表达条件为37℃下重组菌株生长至OD600值为0．7时加入诱导浓度为0．8％的乳糖继续诱导4h。诱导的目的融合蛋白相对表达量能够达到占总蛋白的40-60％水平,接近IPTG的诱导表达水平。结论乳糖能够代替IPTG作为诱导剂成功诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

产L-5-甲基四氢叶酸工程菌自动诱导培养基的优化

考察了自动诱导培养基代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)培养基诱导四氢叶酸还原酶在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,对自动诱导培养基自诱导时的乳糖浓度和葡萄糖添加量进行优化,并与IPTG诱导培养基进行比较,确定了自动诱导培养基配方:葡萄糖1.8 mmol/L、乳糖3 mmol/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10 g/L。HPLC结果显示,自诱导与IPTG诱导条件下的L-5-甲基四氢叶酸产量接近。     

rHAP在大肠杆菌中的诱导条件优化

目的研究用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行重组rHAP的表达。方法研究了rHAP基因工程大肠杆菌的生长、工程菌表达rHAP时IPTG诱导表达的起始工程菌浓度、诱导物IPTG和乳糖的用量及乳糖诱导时间与rHAP表达水平之间的关系。结果在摇瓶实验中,通过优化,选择在培养物的A560值达到3.0时进行诱导剂诱导可以使重组蛋白的表达实现最大化;使用乳糖进行诱导,在浓度0.5 g/L时可以使rHAP的表达量与1 mmol/L的IPTG诱导时相当;诱导时间控制在3 h可使目的蛋白的产生量达到最大,能够占到总可溶性蛋白的20%。结论获得了使用乳糖作为诱导剂获得rHAP的最适诱导条件,降低了成本,为规模化生产打下了基础。     

重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达与复性研究

利用大肠杆菌表达系统,表达猪源羧肽酶原B蛋白包涵体,并对包涵体的体外复性条件进行优化。对猪源羧肽酶原B基因进行设计,优化稀有密码子,并将基因片段插入到pET28a载体中,构建表达质粒pET28a-proCPB,并转化入BL21(DE3)中。通过乳糖诱导表达得到包涵体。通过检测酶的比活力来考查复性液的pH、蛋白终浓度、氧化还原对比例、复性时间、复性温度对复性程度的影响。最终确定的体外稀释复性条件为:复性液成份为100mmol/L Gly-NaOH、pH=9.5、GSH与GSSG的比例为1∶0.8(GSH为1mmol/L)、蛋白终浓度为200μg/ml、复性温度为25℃、复性时间24h。通过检测,复性液中酶的比活力为11.7u/mg,经过DEAE纯化后酶的比活力可达到73u/mg。     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。     

乳糖诱导胸腺融合肽Tα1-TP5在大肠杆菌中的表达

目的研究用乳糖替代异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂诱导胸腺融合肽Tα1-TP5表达,并优化诱导表达条件。方法在摇瓶发酵条件下,以乳糖作为诱导剂,SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和诱导方式等条件对目的肽Tα1-TP5表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较。结果选用TB培养基,在菌体对数生长的中后期加入终浓度为1 g/L的乳糖,37℃诱导6 h,GST-Tα1-TP5融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同。分批流加乳糖4次和一次性加入乳糖诱导,融合蛋白表达量无明显差异。结论乳糖可以替代IPTG诱导胸腺融合肽Tα1-TP5的表达。     

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB (DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达；对影响可溶性表达的4个因素，即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A₆₀₀)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A₆₀₀达到1.0时加入0.4 mmol·L^-1 IPTG，在20 ℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高，约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达产物，纯化蛋白产率达到12.3 mg·L^-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清，ELISA测定效价为1∶24 300，且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原，获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体，为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。