微小RNA-21对宫颈癌HeLa细胞程序性细胞死亡4蛋白表达及细胞增殖的影响

［摘要］目的: 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌HeLa细胞中程序性细胞死亡4(programmed cell death, PDCD4)基因表达及细胞增殖的影响,为应用miR-21对宫颈癌进行基因治疗提供一定的依据。方法: 用脂质体转染的方法,将pre-miR-21、pre-miR-21阴性对照、anti-miR-21、anti-miR-21阴性对照瞬时转染HeLa细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-21相对表达量;MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化;蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达情况;荧光素酶报告基因法验证miR-21的靶位点。 结果: pre-miR-21上调miR-21的表达,抑制PDCD4蛋白表达,促进HeLa细胞增殖;而anti-miR-21下调miR-21的表达,增加PDCD4蛋白的表达,抑制HeLa细胞增殖。pMIR-Luc-PDCD4-3′UTR与pre-miR-21共转染后,荧光素酶活性下降,而与anti-miR-21共转染后,荧光素酶活性升高。 结论: PDCD4基因是miR-21的靶基因;miR-21通过调节PDCD4基因的表达调控细胞增殖。     

46,XY,r(21)伴无精症的细胞遗传学分析

目的通过对1例21号环状染色体综合征患者的细胞遗传学分析,探讨21号环状染色体的形成原因,临床表型与染色体区带的关系。方法应用染色体常规标本、G显带、C显带技术对21号环状染色体进行识别与区带定位。结果患者核型为46,XY,r(21)[90]/45,XY,-21[6]/46,XY,r(21;21)[4]。结论21号环状染色体综合征的临床表现与21q末端缺失的多少相关,男性无精症可能与21q22.3片段的缺失相关。     

干扰miR-21表达抑制胶质瘤U251细胞增殖迁移与侵袭

目的 探讨干扰miR-21表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移和侵袭的影响。方法使用脂质体将miR-21抑制物(人工合成干扰miR-21表达的核苷酸片段,miR-21处理组)以及对照组转染于U251细胞,利用qRT-PCR验证miR-21处理组转染的细胞中miR-21表达水平;通过MTT法、细胞划痕、transwell等实验观察miR-21处理组和对照组对U251细胞增殖迁移和侵袭的影响。结果miR-21 处理组中miR-21的表达量明显下调。即转染miR-21 抑制剂能有效降低U251细胞中miR-21的表达。miR-21 处理组的 U251细胞与对照细胞相比,增殖速度明显下降,差异具有显著性。细胞划痕实验显示干扰miR-21抑制U251细胞迁移能力。Transwell侵袭实验结果显示,miR-21 处理组的U251细胞的侵袭能力较对照组细胞明显下降。结论miR-21能促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,它可能在胶质瘤的发生和进展中发挥重要作用。     

人IL-21cDNA的克隆及重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建含人IL-21基因的重组腺病毒表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤研究奠定基础。方法：从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,将其连接到进入载体pENTR1A,然后经LR重组转入到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中,构建含IL-21基因的腺病毒载体（Ad-IL-21）,并进行测序鉴定和PCR鉴定。结果：Ad-IL-21表达载体测序结果与GenBank中IL-21基因序列一致,Ad-IL-21经PCR扩增出IL-21基因片段。结论：成功构建携带人IL-21基因的重组腺病毒表达载体。     

miR-21对宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响

目的：探讨miR-21与宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性之间的关系,阐明miR-21对细胞凋亡和自噬改变的可能作用机制。方法：人宫颈癌HeLa细胞分为假照组和4 Gy照射组,分别转染miR-21 NC（阴性对照）、miR-21 mimics、miR-21 inhibitor NC和miR-21 inhibitor。实时荧光定量PCR检测照射前和照射后miR-21的表达水平;集落形成实验观察miR-21对HeLa细胞辐射敏感性的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和自噬细胞百分率;采用生物信息学方法预测miR-21的靶基因;荧光素酶报告基因分析验证miR-21与靶基因3′UTR的结合;Western blotting法检测相关蛋白beclin1表达水平。结果：与假照组比较,4 Gy照射组miR-21表达水平明显增加(P<0.05）;集落形成实验,与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 inhihitor NC组比较,miR-21 inhibitor 组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组HeLa细胞凋亡率明显增加(P<0.05）;与miR-21 inhibitor NC组比较,miR-21 inhibitor组HeLa细胞凋亡率明显减少（P<0.05）。与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组自噬率升高（P<0.05）。与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组自噬率升高（P<0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组beclin1蛋白表达水平增加（P<0.05）。
结论：发现了miR-21新的靶基因beclin1。过表达miR-21促进辐射诱导的凋亡和自噬,但对于宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性无直接影响。
［关键词］ miR-21;宫颈肿瘤;HeLa细胞;辐射敏感性;细胞凋亡;自噬     

成纤维细胞生长因子21及其在心血管疾病中的作用

成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21,FGF21）属于新分离的成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors,FGFs）超家族成员,在调节机体糖脂代谢方面具有多效性保护作用。近年来发现,FGF21在心脏和微血管中也有分布。FGF21与动脉粥样硬化、高血压等多种疾病或病理过程相关,而血清中FGF21水平升高有助于预测心血管疾病的发生。本文主要介绍FGF21在上述几种心血管疾病或病理过程中的保护作用及其具体机制。     

因母亲14/21平衡易位导致的先天性愚型

本文报告一患儿染色体G带检查结果,其核型为46,XY,t(14:21)(14q~(ter)→14p~(11 )21p~(11)—21q~(ter)),确诊为14/21易位型21三体综合症。追溯患儿易位染色体形成原因,对患儿父母作染色体检查分析,其父核型为46,XY;其母则是45,XX,t(14:21)(14q~(ter)→14p~(11 21)p~(11)→21q~(ter)),证实其母为14/21平衡易位携带者,患儿易位染色体21三体为其母所传递。具有这样平衡易位核型的人,其子女患先天性愚型的危险比普通人群高70倍左右。因此,检出平衡易位对优生很有价值。     

补髓生血颗粒对慢性髓劳病IL-21和IL-21mRNA的影响

目的通过观察补髓生血颗粒对慢性髓劳病IL-21和IL-21mRNA的影响,分析IL-21和IL-21mRNA与慢性髓劳病发病的相关性,进一步探讨补髓生血颗粒调整免疫失衡的疗效机制。方法选取血液病科2013年8月至2015年3月期间门诊和住院的慢性髓劳病患者30例为试验组,口服补髓生血颗粒治疗,以同期10名健康志愿者为正常对照组。试验组应用ELISA法检测治疗前后IL-21表达变化,RT-PCR法检测治疗前后IL-21mRNA表达的变化。结果试验组慢性髓劳病IL-21和IL-21mRNA的表达高于正常对照组(P 0. 05);试验组治疗后IL-21和IL-21mRNA的表达较治疗前下降(P 0. 05),差异有统计学意义。结论 IL-21和IL-21mRNA在慢性髓劳病中的异常表达,提示可能参与了慢性髓劳病的免疫发病过程;补髓生血颗粒通过下调IL-21和IL-21mRNA的表达,以调整异常的免疫反应,进而恢复骨髓的造血功能。     

应用短串联重复序列快速产前诊断唐氏综合征

目的:采用聚合酶链反应技术(PCR),对短串联重复序列(short tandem repeat,STR)进行分析,探讨应用短串联重复序列信息进行21三体产前诊断的可行性。方法:选取21号染色体核心区域21q22.1-22.3及其附近的三个STR(D21S1409,D21S1433,D21S1444),用聚合酶链技术,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色技术,对30例正常人外周血及40例羊水样品进行分析。结果:30例正常人在三个STR位点均没有发现三条带。40例羊水样品中检测到三例21三体胎儿,两例与细胞染色体分析结果相符,染色体核型均为"47,XY,+21"。一例为21号染色体关键区域微片段重复,细胞染色体分析结果为"46,XY"。三例21三体和部分21三体多余的染色体和部分片段均来自母亲。其余37例羊水样品检测结果为阴性,细胞染色体分析结果也是阴性。D21S1409、D21S1433、D21S1444三个基因座的杂合度分别为:0.75、0.80、0.78。结论:三个STR均具有高度多态性,在21三体的产前诊断中有较高的应用价值。     

IL-21及其受体在银屑病患者外周血和皮损组织中的表达及意义

目的探讨IL-21及其受体在斑块型银屑病患者外周血PBMC和皮损组织中的表达情况及临床意义。方法采用流式细胞仪检测斑块型银屑病58例患者及20例健康对照者外周血PBMC中IL-21、IL-21R的表达;采用实时定量RT-PCR（quantitative real-time, RT-PCR）法检测25例银屑病和15例正常人外周血PBMCs和皮肤组织中IL-21、IL-21R mRNA的表达情况;采用Western印迹法检测皮肤组织中IL-21和IL-21R的表达情况;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测PBMC培养上清液中IL-21的分泌水平。结果流式细胞仪检测发现银屑病患者PBMC中IL-21和IL-21R占CD4+T细胞的百分率明显增加（P<0.01）;Real-time PCR发现IL-21、IL-21R mRNA在银屑病患者的PBMC和皮肤组织中表达均较健康对照者增高（P<0.01,P<0.05）;Western印迹法显示IL-21和IL-21R蛋白在银屑病患者的皮损中表达增高（P<0.01）;ELISA检测发现培养上清中IL-21分泌水平增加（P<0.01）。结论斑块型银屑病患者PBMC和组织中IL-21和IL-21R的表达水平均较健康对照者升高,IL-21可能参与了银屑病的发病过程,并可能成为一个潜在的治疗靶点。     

成纤维细胞生长因子21的糖脂代谢调节功能研究进展

成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21,FGF21）是新近发现的与糖脂代谢有关的特殊成纤维细胞生长因子,它可以通过多种途径参与糖脂代谢的调节。临床研究发现,肥胖和2型糖尿病、代谢综合征等代谢性疾病患者中血清FGF21水平显著增高,这表明血清FGF21可以作为早期发现肥胖相关代谢性疾病的生物标志物。同时,大量研究显示,FGF21可以通过增强胰岛素敏感性,对糖尿病动物模型起到降糖、降脂和减轻体重的作用,提示FGF21可能是治疗肥胖和糖尿病的潜在药物。本文通过对FGF21的来源、功能以及在糖脂代谢方面的作用进行综述,以期为FGF21在临床研究及应用提供新的视角。     

共轭亚油酸对高脂血症大鼠脂质代谢及visfatin基因表达水平的影响

目的测p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBXIHBX转基因小鼠及野生型小鼠的血清生化指标,探讨几种血清生化指标在两种转基因小鼠及野生型小鼠的变化规律。方法对p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBXIHBX转基因小鼠不同月龄11种血清生化指标进行测定并分析比较。结果p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBXIHBX转基因小鼠不同月龄、不同的指标雌雄之间t检验差异显著,并且随着月龄的变化,雌雄之间的变化规律不同。结论p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBXIHBX基因的转入对小鼠的血清生化指标具有一定的影响。     

肺癌中异常增高的RAD21的临床意义及潜在功能预测

目的检测肺癌组织中RAD21(S.Pombe RAD21同系物)的表达水平,探讨其潜在临床意义及功能。方法采用Western blot和免疫组织化学方法检测肺癌组织中RAD21的表达水平;通过Oncomine(肿瘤微阵列数据库)分析RAD21 mRNA在肺癌中的表达情况;应用Kaplan-Meier分析RAD21的表达水平与肺癌患者预后的关系;采用基因集富集分析方法预测RAD21在肺癌中的功能。结果与癌旁组织相比,肺癌组织中RAD21蛋白的表达水平增高。Oncomine数据库结果显示,多个肺癌基因芯片中RAD21的m RNA水平明显增高(P<0.01)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示,RAD21的表达水平与肺癌患者的生存时间存在相关性(P<0.05);基因集富集分析显示,RAD21主要富集于细胞凋亡与细胞周期调控相关的信号通路。结论肺癌中RAD21的表达水平可作为判断肺癌患者预后的生物标志物。RAD21可能通过调控细胞周期和凋亡参与肺癌的发生和发展。     

淋巴瘤患者循环microRNA-21的检测及其临床意义

目的分析淋巴瘤患者外周血中循环microRNA-21(miR-21)的表达,探讨循环miR-21在淋巴瘤早期诊断中的意义。方法收集60例临床确诊的淋巴瘤患者外周血,50名健康体检人群外周血作为正常对照组,用FQ-PCR方法检测miR-21的表达;同时检测对应的临床确诊淋巴瘤患者肿瘤组织及外周血中miR-21的表达,判断二者的相关性。结果 FQ-PCR检测结果显示,淋巴瘤患者外周血中循环miR-21的表达显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=6.9,P<0.000 1);且淋巴瘤患者外周血中循环miR-21的表达与肿瘤组织中miR-21的表达密切相关(r2=0.931,P<0.000 1)。结论外周血循环miR-21检测有望成为淋巴瘤早期诊断的新的分子标志。     

MicroRNA-21在缺血再灌注损伤早期大鼠心肌的表达及抗细胞凋亡作用

目的：观察microRNA-21(miR-21)在缺血再灌注损伤(I/R)早期大鼠心肌的表达及对细胞凋亡的影响。方法：SD大鼠随机分为对照组(冠状动脉注射转染空白对照病毒rAAV9-ZsGreen),miR-21组(冠状动脉注射转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21),Sham组(仅开胸挂线),I/R组(进行I/R处理),I/R+miR-21(转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21后再进行I/R处理)。用Realtime-PCR检测大鼠miR-21水平,免疫组织化学及Western印迹方法检测Bcl-2, Bax,caspase-3水平并计算Bcl-2/Bax比值。结果：冠状动脉注射rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21可使miR-21表达增加4.43倍(P<0.001);与Sham组比较,I/R组大鼠缺血区miR-21水平下调(P<0.05),而非缺血区miR-21升高(P<0.05);与Sham组比较,I/R组再灌注1,2,6 h miR-21水平进行性下降(P<0.05),在同一时间点I/R+miR-21组较I/R组miR-21表达升高(P<0.05);与Sham组比较,再灌注6 h时I/R及I/R+miR-21组Bcl-2增高、caspase-3增高、Bcl-2/Bax降低(P<0.05),与I/R组比较,I/R+miR-21组Bcl-2下调、caspase-3下调、Bcl-2/Bax增高(P<0.05)。结论：I/R早期大鼠心肌缺血区miR-21表达下降,细胞凋亡增加,过表达miR-21可改善细胞凋亡。     

mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

非典型21-羟化酶缺乏症临床诊治进展

<正>21-羟化酶缺乏(21-hydroxylase defect,21-OHD)是由于CYP21等位基因发生突变导致21-羟化酶缺乏所致最常见的先天性肾上腺皮质增生(congenital adrenal hyperplasia,CAH)的一种类型,是人类常见的常染色体隐性遗传性疾病,不同人种发病率不同,大致在1/15 000¹/9 000。既可以表现为经典的21-OHD(生前即有过多的雄激素,因此出生时即有雄激素过多的表现),也可表现为非典型21-羟化酶缺乏症(nonclassic21-hydroxylase defect,NC211/9 000。既可以表现为经典的21-OHD(生前即有过多的雄激素,因此出生时即有雄激素过多的表现),也可表现为非典型21-羟化酶缺乏症(nonclassic21-hydroxylase defect,NC21^OHD),1957年由Jayle等首先描述,出生时无雄激素过多的临床表现,多于儿童期、青少年或成人发病。NC21-OHD的发病率为1/1000OHD),1957年由Jayle等首先描述,出生时无雄激素过多的临床表现,多于儿童期、青少年或成人发病。NC21-OHD的发病率为1/1000^〔1〕,也因人种族不同而     

TRIM21可抑制肝癌细胞的侵袭能力：基于泛素化途径降解β-catenin

目的 探讨TRIM21基因在肝癌侵袭表型中的作用及机制。方法 利用siRNA敲低肝癌细胞MHCC 97H,HCC LM3中的TRIM21、β-catenin基因,将肝癌细胞分为对照组：转染对照siRNA;TRIM21敲低组：转染siTRIM21 RNA;CTNNB1敲低组：转染siCTNNB1 RNA;双敲低组：共转染siTRIM21 RNA及siCTNNB1 RNA。利用Western blotting验证敲除效率及相关通路的激活或抑制情况。通过Transwell侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭性。通过尾静脉注射敲低TRIM21的HCC LM3细胞构建裸鼠肺转移模型以观测其肺转移能力。在HEK 293细胞中过表达TRIM21,将HEK 293细胞分为对照组：加入转染试剂;过表达组：转染flag-TRIM21。并利用Co-IP检测TRIM21蛋白与β-catenin的相互作用及泛素化水平。生信分析TCGA数据库中CTNNB1highTRIM21high和CTNNB1highTRIM21low两种亚型肝癌的预后。结果 敲低TRIM21可以显著增强肝癌细胞MHCC 97H和HCC LM3的侵袭能力（P<0.01,P<0.05）和HCC LM3细胞的肺转移能力（P<0.01）。机制研究发现,TRIM21可通过泛素化蛋白酶体途径降解β-catenin以减少其入核,进而降低肝癌细胞的的侵袭性（P<0.0001,P<0.05）。由于TRIM21表达水平降低使肝癌细胞中Wnt信号通路激活,最终使 CTNNB1highTRIM21high亚型肝癌患者的生存预后明显优于 CTNNB1highTRIM21low亚型肝癌患者（P<0.05）。结论 TRIM21能通过泛素化途径降解β-catenin来抑制肝癌细胞的侵袭性,这可能导致了CTNNB1highTRIM21low肝癌患者预后较差。     

21-三体患儿的年轻双亲染色体随体联合率的研究

观察了10对21—三体患儿的23～34岁父母的外周血淋巴细胞G显带染色体随体(S)联合率,另对相应年龄内的正常夫妇和曾流产3次及有流产、死胎史以及生产过其他类型畸胎者夫妇各10对作了观察比较。结果:21—三体患儿双亲组的染色体21-D及21-G的S联合率明显高于其他4组(P<0.01)。初步认为:年轻夫妇的21-D及21-G S联合率增高者,生育21—三体患儿的可能较大,应仔细作产前诊断,防止21—三体患儿诞生。     

FGF21[Tyr20]突变体的克隆、表达及纯化

目的：将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法：以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物（SUMO）融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］,克隆至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,Sephadex G-50除盐。结果：通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论：成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21［Tyr²⁰］的突变体基因,获得FGF21［Tyr²⁰］蛋白。