腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.     

瘤体内注射肿瘤坏死因子重组腺病毒对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的:观察腺病毒重组肿瘤坏死因子(TNF)基因转染对大鼠乳腺癌细胞Walker256体内致瘤性的影响及瘤体内注射TNF重组腺病毒对Walker256荷瘤大鼠的治疗作用.方法:Walker256乳癌细胞感染人TNF重组腺病毒后,观察其体外增殖能力、皮下致瘤性的变化及进行肿瘤局部病理学检查;瘤体局部注射TNF重组腺病毒(Ad.hTNF),观察荷瘤大鼠的肿瘤生长情况及生存期.结果:Walker256感染人TNF重组腺病毒后,培养上清中24 h TNF的分泌量达5.2 ng/106细胞,细胞形态学无明显变化,体外增殖能力和皮下致瘤性显著下降,瘤体周围有大量淋巴细胞及单核细胞浸润;肿瘤局部注射Ad.hTNF能显著抑制Walker256的生长,并延长荷瘤大鼠的生存期.结论:重组腺病毒能有效介导TNF基因转染Walker256细胞,瘤体内局部注射Ad.hTNF对Walker256荷瘤大鼠具有明显的治疗作用.     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的 探讨外源性Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法 运用携带Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株012，观察其体内和体外的抑癌效果。结果 腺病毒表达载体可有效地将外源性Rb基因转染012细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明：导入Ad-Rb基因的肿瘤细胞，其细胞生长曲线明显受抑制，Ad-Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢，与DL312和PBS对照组比较有显著性差异（P＜0．05）。结论 腺病毒介导的外源性Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株，并抑制其生长。     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。     

小鼠干扰素-γ基因克隆及其腺病毒载体的构建

目的 构建含有小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的腺病毒载体,为探索IFN-γ在肝纤维化治疗中的作用研究奠定基础.方法 从含有mIFN-γ 基因的质粒载体pORF5-mIFN-γ 中PCR扩增出mIFN-γ 基因片段,双酶切将该基因克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中,限制性内切酶PmeⅠ线性化pAdTrack-CMV-mIFN-γ,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌株BJ5183细胞,同源重组.卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-mIFN-γ,内切酶PacⅠ线性化重组子,用磷酸钙法转染细胞株AD-293进行包装,收集病毒进行鉴定.结果 PCR后测序获得mIFN-γ基因,全长468 bp,与GenBank中发表的mIFN-γ 基因核苷酸序列完全一致.经酶切和PCR证实各中间过程载体均含有目的 基因.包装的病毒Ad-mIFN-γ在转染的4～6 d观察到荧光产生,8～11 d荧光逐渐增加,12 d收集病毒液.蛋白酶K裂解重组腺病毒,经PCR和Western blot方法鉴定,证实携带有目的 基因mIFN-γ.结论 大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的 基因的腺病毒载体pAd-mIFN-γ,重组子能够在AD-293细胞中进行包装和扩增,病毒包装的成功为进一步研究mIFN-γ 基因治疗小鼠肝纤维化提供了一个良好的转导载体.     

pEGFP-IL-24对B16F0细胞抑制效应的实验研究

目的:构建IL-24真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16F0细胞后,经激光扫描共聚焦显微镜观察其表达,用MTT法检测B16F0细胞的体外增殖能力。用小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤生长的抑制。结果:pEGFP-IL-24转染B16F0细胞后,LSM可观察到其表达。IL-24基因转染的B16F0细胞体外增殖能力明显受到抑制。转染IL-24的B16F0细胞体内致瘤率降低。结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。     

肿瘤生物治疗新方法的研究

本文主要简述"九五"攻关期间<肿瘤生物治疗新方法的研究>课题组经协作攻关主要完成的研究工作(1)重组人TNF、IL-2及B7重组腺病毒表达载体的构建及其包装体系的建立;(2)腺病毒介导的人TNF-α基因转染对人肝癌细胞凋亡和MHC-1类分子表达的影响;(3)瘤体内/瘤周注射TNF-α重组腺病毒和(或)IL-2重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用及其免疫机理研究;(4)粘附LAK细胞的制备、体外扩增、冻存及复苏;(5)转染B7、IL-2、TNF-α基因重组腺病毒的肿瘤细胞及A-LAK的生物学特性研究;(6)人肝癌组织中MAGE基因的表达及MAGE基因修饰树突状细胞体外抗肿瘤作用;(7)转基因瘤苗临床应用安全性的初步检测.这些研究工作的完成为肿瘤基因治疗的临床应用打下基础.     

腺病毒载体介导的野生型P53基因对前列腺癌细胞生长和致瘤能力的抑制效果

目的　为探讨用腺病毒载体携带野生型P53基因作为前列腺癌基因治疗的可能性。方法　应用重组人携带野生型P53基因病毒 (Ad WTP53)感染培养的前列腺癌细胞 ,观察表达P53基因蛋白的癌细胞与对照组癌细胞的体外生长和裸鼠体内致瘤能力变化 ,对荷瘤裸鼠瘤体周围注射Ad WTP53,观察治疗组和对照组肿瘤生长的变化。结果　感染Ad WTP53的前列腺细胞体外生长和裸鼠体内致瘤能力明显下降 ,荷瘤裸鼠瘤体周围注射Ad WTP53后肿瘤生长速度明显减慢。结论　证实了野生型P53基因是一种抑癌基因 ,提示其可能被应用于前列腺癌的基因治疗研究     

腺病毒载体介导的CD自杀基因体外抑瘤效果观察

目的:构建含CD基因的腺病毒载体pAd-CD, 进行肿瘤的自杀基因治疗.方法:分别构建了含CD基因和LacZ基因的重组病毒质粒载体,同质粒pJM17共转染293细胞同源重组后包装为感染性腺病毒颗粒,经滴度测定后,体外分别感染小鼠前胃癌肿瘤细胞MFC.结果:感染Ad-LacZ的细胞可被X-gal染成蓝色,感染Ad-CD的细胞予前药5-FC可见肿瘤细胞杀伤效果明显.结论:腺病毒载体可有效地转CD和LacZ基因进入肿瘤细胞,C D基因作为自杀基因进行体外肿瘤治疗效果明显,本实验构建的新载体及结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了基础.     

γ-干扰素基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的生物学特性

目的 研究重组腺病毒介导的小鼠γ -干扰素 (mIFN -γ)基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法 按重复感染度 (MOI)=1∶100转染G422细胞 (G422/mIFN -γ细胞 ) ,检测转染后不同时间mIFN -γ的表达 ;MTT法检测基因转染细胞的体外增殖活性 ,设立转染LacZ基因的病毒对照细胞和野生G422对照细胞。观察基因转染细胞接种于小鼠皮下后的成瘤性和小鼠存活期 ,LDH法检测荷瘤小鼠脾自然杀伤细胞 (NK)、细胞毒T淋巴细胞 (CTL)及腹腔巨噬细胞 (MΦ)杀伤活性。结果 mIFN -γ基因转染后2h即可在培养上清中检测到mIFN -γ表达。腺病毒mIFN -γ基因转染对体外G422细胞增殖能力无影响,而接种体内后肿瘤生长缓慢 ,小鼠存活期延长。G422/mIFN -γ细胞接种组小鼠脾NK、CTL及腹腔MΦ杀伤活性显著增强 (P<0.05)。结论 重组腺病毒可介导IFN -γ基因转染G422细胞并高效表达。IFN -γ基因转染的G422细胞具有瘤苗的作用 ,能诱导抗肿瘤免疫反应。     

TIM2基因修饰的H22细胞体内成瘤作用的研究

目的观察小鼠TIM2基因修饰的H22肝癌细胞在小鼠体内的成瘤作用，初步研究TIM2基因在肿瘤生物治疗中的作用。方法构建TIM2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP—TIM2，脂质体法转染H22细胞，体外筛选得到稳定表达TIM2基因的阳性单克隆H22细胞株，用以建立小鼠肝癌移植瘤模型，同时以转染了pIRES2-EGFP空载体的H22-EGFP细胞和H22细胞做为对照，观察不同处理的H22细胞对小鼠的成瘤情况。结果重组真核表达载体pIR3ES2-EGFP—TIM2转染H22细胞后，经体外筛选和鉴定，得到稳定表达EGFP和TIM2基因的阳性单克隆细胞株H22-TIM2，免疫接种小鼠后可明显抑制小鼠肿瘤的发生和发展，小鼠肿瘤组织块的体积明显小于接种H22-EGFP细胞和H22细胞组。此外。接种H22-TIM2细胞组小鼠的生长情况也明显好于其他各组。结论TIM2基因转染H22细胞后可显著降低小鼠H22肝癌细胞的成瘤性，抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究为进一步探讨TIM2在肿瘤生物治疗中的作用提供了初步的实验依据。     

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

病毒介导多种基因对胆管癌细胞免疫原性的影响

目的 探讨IFN－γ、IL－2或B7－1基因修饰对胆管癌细胞免疫原性的作用。方法 构建携带人IFN－γ或IL－2基因的逆转录病毒表达载体，和含人B7－1基因的腺病毒载体，导入胆管癌细胞系QBC939，运用淋巴细胞杀伤试验、肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤性分析、混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养，研究导入的目的基因对QBC939细胞免疫原性的影响。结果 导入IFN－γ基因的QBC939细胞体外能增强胆管癌病人外周血淋巴细胞杀伤亲本瘤细胞的活性；导入IL－2基因的QBC939细胞在裸鼠体内的成瘤性降低；导入B7－1基因的QBC939细胞能刺激外周血T淋巴细胞的增殖。结论 人IFN－γ、IL－2和B7－1基因修饰能增强胆管癌QBC939细胞的免疫原性。     

胰岛素样生长因子受体靶向性基因导人系统的体外和体内导人瘤谱

目的 通过研究E5基因导入系统的体外、体内基因导入瘤谱,建成一个平台技术：一个基因导入系统可用于多种肿瘤的基因治疗。方法 应用E5基因导入系统在体外、体内转移报告基因到IGF I R阳性的多种肿瘤细胞与裸小鼠皮下肿瘤。结果 E5基因导入系统在体外转移报告基因到富于IGF I R的5种肿瘤细胞,在体内将报告基因转移到IGF I R阳性裸小鼠皮下肿瘤,其导入率与IGF I R表达水平呈正相关。而体外、体内均不能将报告基因导入到IGF I R阴性的肿瘤细胞和裸小鼠皮下肿瘤。结论 E5基因导入系统具有相对的靶向性与广谱性,在临床基因治疗研究和应用中具有潜在的价值。     

外源性p16基因与放疗联合治疗喉鳞癌的实验研究

目的　探讨外源性 p16基因对人喉鳞状细胞癌的抑制作用及与放射治疗联合应用的协同增敏作用。方法　应用携带 p16基因的复制缺陷型腺病毒 (Ad- p16 )转染人喉鳞癌细胞株 ,用 Western Blot方法检测 p16基因在喉鳞癌细胞中的表达 ,体外、体内实验观察 p16基因治疗和放射治疗对喉癌细胞的生长抑制作用。结果　复制缺陷型腺病毒载体可有效地将外源性 p16基因转染入人喉鳞癌细胞株中并使其表达 P16蛋白 ;体外、体内抑瘤实验表明 :Ad- p16基因治疗组、单纯放疗组和 Ad- p16基因与放疗联合治疗组肿瘤生长均明显受抑制 ,疗效显著优于携带 L ac Z基因的重组腺病毒 (Ad- L ac Z)组和 PBS对照组 (P<0 .0 5 ) ,其中联合治疗组肿瘤生长最为缓慢 ,与 Ad- p16基因治疗组和单纯放疗组比较均有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　 p16基因可有效地抑制人喉鳞癌细胞生长 ,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的　探讨外源性 Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法　运用携带 Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株 0 12 ,观察其体内和体外的抑癌效果。结果　腺病毒表达载体可有效地将外源性 Rb基因转染 0 12细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明 :导入 Ad- Rb基因的肿瘤细胞 ,其细胞生长曲线明显受抑制 ,Ad- Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢 ,与 DL312和 PBS对照组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　腺病毒介导的外源性 Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株 ,并抑制其生长。     

腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征

目的 探讨含hB7-1基因的重组腺病毒hCD80rAd对B16－F10肿瘤细胞体外生物学特性的影响。方法 以腺病毒为载体，将CD80基因导入B16－F10肿瘤细胞后，以PCR方法检测基因导入，以电镜、FACS等方法观察对其体外生物学特性的影响。结果 重组腺病毒的滴度可达10^10PFU/mL,200MOIs rAd可使95％以上的B16－F10细胞被感染。转染CD80基因后，B16－F10细胞的生长能力、克隆形成能力等均无变化，电镜下，细胞表面结构及胞内超微结构有轻微变化。结论 重组腺病毒hCD80rAd可以有效地将hCD80基因导入肿瘤细胞而不会引起明显的生物学特性改变，制备肿瘤苗是可行的。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

制备淋巴瘤多基因肿瘤疫苗的方法学探索

目的探讨用于淋巴瘤的多基因肿瘤疫苗的制作方式及淋巴瘤的基因治疗方法。方法采用腺病毒转染、脂质体辅助转染、脂质体辅助腺病毒转染的方式,将带GFP的载体转染B系淋巴瘤A20细胞株,并以Hela细胞作为对照,荧光显微镜下观察转染效率。将B7-1与CD40L表达载体联合导入A20荷瘤小鼠肿瘤内,观察肿瘤生长情况,应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况。结果对A20细胞而言,单纯脂质体和单纯腺病毒转染效率均非常低,脂质体辅助腺病毒转染效率有所提高。但均显著低于采用腺病毒转染Hela细胞。瘤内联合注射B7-1和CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓及体积缩小,肿瘤消退效应较明显。肿瘤形态学观察表明,治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死,肿瘤局限化。结论B系淋巴瘤细胞株难于通过体外基因导入制作肿瘤疫苗,脂质体辅助腺病毒转染效果较好,质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。