绿色荧光蛋白标记的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型

目的 建立新型裸鼠脉络膜恶性黑色素 瘤原位移植瘤模型。 方法 利用脂质体将绿色荧光蛋白（GFP）真核表达 质粒pEGFP-N₁转入人脉络膜恶性黑色素瘤细胞（OC-1），新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。将2 μl细胞浓度为4.5×10⁷~5.5×10⁷个/ml的细胞悬液注射到麻醉后的40只裸鼠右眼视网膜下间隙，左眼不注射作为对照眼。手术后利用带荧光的体视显微镜连续观察肿瘤生长情况，分别于肿瘤生长的眼内期、眼外期及衰竭期处死动物，荧光显微镜观察裸鼠视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况，并行肿瘤组织的GFP免疫组织化学染色。 结果 手术后10~12 d肿瘤开始生长，血管扩张、扭曲，新生血管形成；手术后20~22 d肿瘤占满玻璃体腔；手术后24~26 d肿瘤生长至眼外；眼外期后，迅速进入衰竭期，衰竭期嗅球、肾、肺、肝脏有转移灶。移植瘤病理组织学表现类似于人脉络膜恶性黑色素瘤；免疫组织化学染色肿瘤细胞GFP染色阳性。 结论 以GFP基因标记的OCM-1经裸鼠视网膜下间隙移植建立的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型，为研究自然状态下肿瘤的生长和转移提供了一个新的方法。 （中华眼底病杂志，2004，20：245-248）     

人视网膜母细胞瘤裸小鼠移植瘤的建立及有关生物学特性的研究

报道一株人视母细胞瘤裸小鼠移植瘤的建立。该移植瘤生长于裸小鼠皮下，能稳定传代，现已传至第１４代。移植瘤及原发瘤的光镜，电镜，免疫组化，流式细胞检测及染色体分析结果表明，该株移植瘤较好地保存了其原发瘤的主要生物学特性，可用于以后的有关实验研究。     

视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞NOD-SCID鼠皮下异位移植全身转移瘤模型的建立

目的：建立人视网膜母细胞瘤（RB）的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficent）小鼠（NOD-SCID鼠）皮下移植模型,并探讨RB转移的发生、分布规律。方法：NOD-SCID小鼠皮下接种人视网膜母细胞SO-RB50细胞,定期观察小鼠的行为及肿瘤的形成、生长、转移。采用HE,免疫组织化学染色方法,对皮下肿瘤原发灶及远处转移灶行病理组织学研究。结果：皮下接种小鼠肿瘤生长的潜伏期为12-19d,成瘤为100％,5只鼠有远处转移灶,发生转移的时间在32d后,时间分布不一,肿瘤转移灶主要分布在腹腔和肾旁,小鼠的异种移植瘤和转移灶组织形态上与人类的RB一致,光镜下细胞胞质少、核深染、可见病理性核分裂,为未分化型。结论：NOD-SCID小鼠的荷瘤人视网膜母细胞瘤模型,成瘤率高,成瘤潜伏期短,较高转移率的特点。     

绿色荧光蛋白标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞眼前房移植模型

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞cy15在眼前房生长及浸润的模型,探讨cy15细胞在前房生长的规律及GFP标记活细胞的优势。方法将带有GFP的逆转录病毒MP71-GFP-PRE转入cy15瘤细胞,获得稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。20只BALB/C小鼠(20只眼)每只眼前房注入2μl细胞密度为2×106个/ml的cy15GFP瘤细胞悬液,术后分别在裂隙灯和荧光显微镜下观察瘤细胞在前房的生长情况,连续观察30d,分别在瘤细胞植入前房后第15d、20d、30d时处死小鼠做眼球HE病理切片。结果成功地建立了稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。接种的20只BALB/c鼠眼前房均可见肿瘤细胞生长,借助于荧光显微镜能动态地观察到肿瘤细胞在活体小鼠眼前房的生长浸润过程。结论建立的GFP标记的肿瘤细胞眼前房接种模型为研究眼内肿瘤细胞生长与浸润的规律以及抗肿瘤药物的筛选提供了一种新的手段。     

绿色荧光蛋白在视网膜疾病研究中的应用

从海洋无脊椎动物体内分离出的绿色荧光蛋白(GFP),是一种极具潜力的标记物。其 内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光,且荧光性质稳定,与现有的标 记物相比,GFP具有无可比拟的优势。在视网膜疾病基因治疗的研究中,GFP具有广阔的应用前景。     

视网膜母细胞瘤基因对视网膜母细胞瘤移植瘤细胞周期的影响

目的 观察外源性视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)移植瘤细胞周期的影响。 方法 在建立裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤模型及构建Rb基因的逆转录病毒表达载体PBabe-Rb的基础上,用脂质体Dosper介导法将Rb基因导入裸鼠RB移植瘤,流式细胞仪检测RB移植瘤细胞周期变化。 结果 Rb基因在RB移植瘤内的表达使RB移植瘤G₁期细胞数明显增加,DNA指数及S期百分比值有所降低。 结论 外源性Rb基因可部分抑制RB移植瘤细胞周期的进程。（中华眼底病杂志,2000,16：1-70）     

视网膜母细胞瘤细胞系裸小鼠玻璃体腔的异种移植

目的 建立裸小鼠玻璃体腔异种视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)移植瘤模型，用于RB的体内基因治疗试验。 方法 将来源于人的RB细胞系HXO-Rb₄₄制成细胞悬液注射于10只裸小鼠20只眼的玻璃体腔。随机将裸小鼠分为2组，第1组5只鼠10只眼，每只眼注5μl；第2组5只鼠10只眼，每只眼注10μl。用肉眼和直接检眼镜对裸小鼠RB模型作活体观察和半定量分级；用光镜、电镜对移植瘤作组织病理形态观察；用卵白素-生物素-过氧化物酶复合法(avidin-biotin-complex method,ABC法)进行神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase,NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的免疫组织化学染色检查和流式细胞仪测定其DNA指数(DNA index,DI)及S期细胞百分比(s-phase fraction,SPF)。 结果 在裸小鼠眼玻璃体腔内均成功地形成了移植性RB肿瘤。移植瘤对NSE呈阳性反应，对GFAP呈阴性反应。DI值大于1.1,SPF检测表明移植瘤细胞有增殖活性。结论 裸小鼠玻璃体腔内RB异种移植瘤形态学和免疫组织化学特征均与人类RB细胞相似，是进一步进行RB治疗研究的一个较好动物模型。(中华眼底病杂志,1998,14:144-148)     

视网膜母细胞瘤裸小鼠移植瘤中nm23基因的 表达及意义

目的观察肿瘤转移抑制基因nm23的表达产物二磷酸核苷激酶（nucleoside diphosphat kinase,NDPK）在裸小鼠玻璃体腔视 网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）移植瘤中的表达状态,探讨nm23基因的表达产物 NDPK（nm23/NDPK）与RB的发生发展及浸润生长的相关性。方法对20例裸小鼠玻璃体RB移植瘤进行nm23／NDPK表达的免疫组织化学染色,以正常视网膜组织标本作对照,比较RB移植瘤眼内生长期（Ⅰ～Ⅲ级）及蔓延、扩展浸润期（Ⅳ ～Ⅴ级）nm23／NDPK的表达情况。结果正常视网膜组织nm23蛋 白表达阴性。20例RB移植瘤nm23／NDPK表达阳性,阳性细胞数为48．73±2．37,阳性表达率为100%;眼内生长期（Ⅰ～Ⅲ级）与蔓延、扩展浸润期（Ⅳ～Ⅴ级）　nm23/NDPK阳性表 达细胞数差异无显著性的意义(P>0.05)。结论nm23基因不具有抑制RB移植瘤蔓延浸润的功能,而是在其发生发展过程中起一定作用。(中华眼底病杂志,2001,17:47-49)     

视网膜母细胞瘤动物模型的研究进展

视网膜母细胞瘤动物模型的建立对研究肿瘤的发生机理,正确评价各种治疗方案等具有重要的意义.本文对视网膜母细胞瘤动物模型从裸鼠移植瘤模型到转基因小鼠模型的发展,其原理、实验方法和特点,以及最新的研究动态进行综述.     

重视对视网膜母细胞瘤浸润转移的研究

颅内或全身转移和第二恶性肿瘤是视网膜母细胞瘤（RB）患儿死亡的主要原因。肿瘤的浸润转移是一个渐进连续的动态过程,是肿瘤细胞及其周围环境相互作用的结果;肿瘤细胞的起源、异质性、干细胞特性、黏附性、迁徙性、侵袭性、抗凋亡性、促血管性等都可影响肿瘤细胞浸润转移能力,并受多种肿瘤转移抑制基因和微小RNA的调节。深入研究RB细胞发生浸润转移的临床特征和生物学机制,有助于提高我国RB的防治水平。     

人免疫重建的非肥胖型糖尿病-重症复合性免疫缺陷小鼠联合视网膜母细胞瘤荷瘤模型的建立

目的建立人免疫重建的非肥胖型糖尿病-重症复合性免疫缺陷（NOD—SCID）小鼠和人视网膜母细胞瘤（RB）动物模型,并观察其生物学特性。方法NOD—SCID鼠20只,采用计算机随机数字表法分为4组,即空白组（仅注射磷酸盐缓冲液）、人化组（仅注射人淋巴细胞）、荷瘤组（仅注射瘤细胞SO—RB50）及人化荷瘤组（注射人淋巴细胞及瘤细胞SO—RB50）,每组各5只鼠。常规分离健康成人外周血淋巴细胞,分别腹腔注射到人化组及人化荷瘤组小鼠。24h后,对单纯荷瘤组和人化荷瘤组鼠双侧腹股沟皮下接种人RB细胞株SO—RB50。定期观察小鼠的健康情况及移植瘤生长、转移情况。采用组织病理学、酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞仪等方法检测小鼠人免疫功能重建情况及所生长肿瘤特性。结果荷瘤组及人化荷瘤组RB皮下移植瘤潜伏期为12～19d,成瘤率为100％,形态学及免疫组织化学特点与人类的低分化RB一致,移植瘤内可见人白细胞共同抗原（LCA）阳性淋巴细胞浸润。免疫重建后9d,在人化组及人化荷瘤组鼠检测到人IgG存在,且随时间延长其含量逐渐升高;免疫重建后26d,小鼠血液内检测到人CD3^＋ T淋巴细胞,人化荷瘤组为27．1％,人化组为25．5％。由此表明,人化组及人化荷瘤组鼠也获得了人的体液免疫及细胞免疫功能。结论初步建立人免疫重建的NOD-SCID鼠和人RB皮下移植瘤模型,较好地模拟了有免疫功能情况下人RB的生物学行为,为研究RB肿瘤的发生、发展及其免疫防治提供了一个较为理想的动物模型。     

视网膜母细胞瘤细胞分化程度对扩散和 存活预后的影响

目的探讨视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）细胞分化程度对扩散和存活预后的影响。方法对156份RB眼球标本 进行组织病理学观察,根据肿瘤细胞分化程度将其分为分化型与未分化型,注意有无肿瘤细 胞的扩散,并统计两型发生扩散的比率。对随访到的82例RB患者进行死亡率统计。用检验的方法比较两型间死亡率和扩散发生率。记录扩散部位与死亡率之间的关系、死者生前眼球摘除术后平均存活时间。结果分化型RB　17例17只眼,发生肿瘤细胞局部扩散8只眼,占47.06%;未分化型137例139 只眼,发生局部扩散66只眼,占47.48%。两型间发生扩散的比率差异无显著性意义（P>0.05）。随访到的患者中,分化型RB死亡率27.27%,未分化型RB死亡率22.54%,二者比较差异亦无显著性意义（P>0.05）。眶内和巩膜侵犯者死亡率100%,视神经侵犯Ⅳ级者死亡率62.50%,葡萄膜侵犯者死亡率22.22% 。眼球摘除术后生存时间为5～41个月,平均21.92个月。结论分化型与未分化型RB的存活预后及局部扩散比率差异无显著性意义。发生扩散的RB,无论是分化型还是未分化型其预后均取决于扩散的程度以及是否进行积极治疗。(中华眼底病杂志,2001,17:18-20)     

早期视网膜母细胞瘤激光光凝治疗效果

目的总结早期视网膜母细胞瘤激光光凝治疗的初步疗效。方法回顾性病例研究。收集2012年5月至2012年8月4例（4眼）在我科确诊为早期视网膜母细胞瘤（RB）的患儿,住院且行局部激光光凝治疗,随访6~12个月。4例患儿中男3例,女1例。就诊年龄最小2个月,最大1岁。其中1例有家族史,其余3例为散发病例。4例肿瘤距离黄斑>3.0 mm,距离视神经>1.5 mm,均没有玻璃体或视网膜下的种植,肿瘤直径均≤3.0 mm。结果4例患儿至随访期末肿瘤呈退缩模式。结论单病灶早期RB可单独使用局部疗法,激光是有效的局部治疗方法。     

视网膜母细胞瘤多药耐药相关蛋白的研究

目的 检测P-糖蛋白(P-Gp)、多药耐药基因相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)在视网膜母细胞瘤(Rb)中的表达及临床意义;初步分析Rb患者临床病理指标与MRP间的关系;探讨Rb多药耐药现象的可能机制.方法 实验研究.应用免疫组织化学染色方法检测P-gp、MRP、LRP在75例Rb肿瘤标本中的表达情况.分析3种蛋白表达的相关性及其与患者年龄、性别、眼别、临床表现、组织病理分化程度等临床病理指标的相关性.各蛋白表达情况与一般临床特点、组织病理学特征的比较采用卡方检验,各蛋白间的相关性采用多元相关分析.结果 P-Gp、LRP、MRP蛋自在Rb中阳性表达率分别为64.0%、25.3%、36.0%.P-gp与LRP、P-gp与MRP、LRP与MRP的共表达阳性率分别为18.7%、32.0%、20.0%.P-gp、LRP、MRP在分化型Rb组织中的阳性表达率均高于杀分化型,且组间差异具有统计学意义(χ2=8.002,χ2=17.327,χ2=28.421;P<0.05).3种蛋白的表达均与年龄、性别、眼别无关(χ2=0.003～3.385,P>0.05).P-gp、LRP的表达分别与MRP的表达其有相关性(r=0.389,r=0.521;P<0.05).结论 Rb原发性多药耐药的形成是一个多因素、多步弱的复杂过程,与包括P-gp、LRP、MRP等在内的多项因素的参与有关.P-gp、LRP、MRP蛋白可以作为反映Rb耐药的分子基础,耐药相关标志的联合检测更有利于准确判断Rb的多药耐药状态,为Rb化学治疗提供科学的理论依据.     

381例视网膜母细胞瘤侵及视神经的相关因素分析

目的探讨视网膜母细胞瘤（RB）侵犯视神经的相关危险因素。方法回顾性分析1990至2002年381例患儿的临床和病理资料,对其性别、年龄、眼别、病程、临床表现、临床分期及组织学分型与视神经侵犯程度进行分析。结果RB患儿视神经受侵犯的程度与病变临床分期、肿瘤组织学分型有一定关系（P〈0．01）。结论减少视神经受累的危险因素对RB的预后有重要意义。（中华眼科杂志．2007,43：489-492）     

经绿色荧光蛋白基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp的生物学行为与基因表达

目的 研究经绿色荧光蛋白（GFP）基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp在小鼠体内的生长过程、转移规律，以及可能影响肿瘤生长和转移的因素。 方法 用脂质体将GFP基因导入人脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，建立稳定、高水平表达GFP的克隆;分别接种到Balb/c裸鼠视网膜下和后大腿皮下，建立原位和异位肿瘤模型。眼内肿瘤生长情况用荧光显微镜直接观察，皮下肿瘤大小用游标卡尺测量;采用免疫组织化学方法对肿瘤内13种基因的表达进行检测。 结果 稳定表达GFP的脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1-gfp基本保持了亲代细胞的特征;能在裸鼠体内形成肿瘤并继续生长和转移;在基因表达方面，肿瘤抑制基因p16染色呈阴性，p53染色呈强阳性。其他的肿瘤抑制基因:视网膜母细胞瘤易感基因（Rb）、p21，转录调控因子（E-2F）、核因子κB（NFκB），细胞增生相关基因细胞周期素D1（cyclin D1）、增生细胞核抗原（PCNA），细胞凋亡相关基因bcl-2、bcl-XL/S和bax，以及表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）呈现不同程度的阳性表达。 结论 GFP为直接观察脉络膜黑色素瘤在体内的生长和转移提供了标记;脉络膜黑色素瘤原位与异位移植瘤模型在成瘤率和生长情况方面无明显差异;由OCM-1-gfp生长形成的肿瘤p16、p53及NFκB、cyclin D1、PCNA及EGF和EGFR等多种基因表达异常。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 170-173)