核糖体失活蛋白Luffin P1的构建

目的:构建免疫毒素Luffin P1的基因原核表达载体,获得免疫毒素Luffin P1,并对其进行鉴定及纯化.方法:设计寡聚核苷酸片段连接延长合成全长Luffin P1,PCR扩增后将其克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达蛋白Luffin P1,Western blot鉴定.结果:成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-Luffin P1,获得纯化的免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论:通过基因工程成功表达免疫毒素Luffin P1,简化了其制备过程,有利于对其进一步研究应用.     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI+的表达纯化

目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI .     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a( )T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a( )-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a( )中,构建重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a( )-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a( )-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

人源性MIF cDNA的克隆及其原核高效表达的研究

目的克隆人MIF cDNA并构建其高效原核表达载体,表达和纯化得到高纯度的可溶性hMIF蛋白.方法经RT-PCR从人乳腺癌细胞株MDA-MB453中扩增到hMIF cDNA,并克隆到原核表达载体pET11b中.测序验证后将其转入大肠杆菌BL21中表达,最后经离子交换和疏水层析法纯化hMIF蛋白.结果克隆到的hMIF cDNA与Genebank已发表的序列完全一致,纯化得到的产物经Western blotting鉴定证实为hMIF蛋白.结论应用基因重组技术成功构建了pET11b/hMIF重组质粒,在大肠杆菌中实现了高效表达;纯化到高纯度的可溶性hMIF蛋白,为治疗性抗hMIF抗体的研究创造了条件.     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对大鼠肾移植存活时间的影响

目的 以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用.方法 采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察.结果 hIL-2-Luffin P1组大鼠存活时间延长(13.86±2.11)d,与对照组比较相差显著(P＜0.01);而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异.同时,病理结果显示对照组移植肾单位结构破坏,淋巴细胞浸润明显,而在同一时间hIL-2-Luffin P1处理组大鼠的移植肾脏病理变化较轻;T淋巴细胞亚群检测显示经hIL-2-Luffin P1处理后,受体外周血T细胞的活化程度降低.结论 hIL-2-Luffin P1能够抑制免疫排斥反应,延长移植物存活时间.     

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。     

mMIP-1α-DT390重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达研究

目的 构建小鼠MIP-1α(mMIP-1α)基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的真核融合表达载体,并对其功能进行初步研究.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,插入含DT390基因的真核质粒SRα,获得真核表达载体SRα-mMIP-1α-DT390.重组载体经PCR、限制性内切酶酶切及DNA序列测定鉴定,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测目的蛋白的表达,并利用转染NIH3T3细胞后的培养上清体外测定mMIP-1α-DT390融合蛋白的选择性细胞毒活性.结果 成功构建真核表达质粒SRα-mMIP-1α-DT390,mMIP-1α-DT390融合蛋白可在NIH3T3细胞株中正确表达,细胞转染上清对小鼠活化T淋巴细胞具有较强的细胞抑制效应.结论 mMIP-1α-DT390融合基因真核表达载体的获得及功能的部分研究为进一步研究其抗炎效果和临床应用奠定基础.     

分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达

目的构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达载体pIRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402／shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平。结果荧光显微镜下观察可见H7402／shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β。     

人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。     

人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测

目的克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrap TMF Fcolumn亲合纯化,SDS-PAGE和Westernblot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用。结果克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50kD大小的融合蛋白表达。GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长。结论成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白对宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用。     

人白细胞介素-22的克隆及原核表达

目的克隆hIL-22成熟链基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达。方法采用反转录PCR以及巢式PCR的方法克隆得到hIL-22基因。将hIL-22基因装入PQE3.0载体构建重组载体hIL-22/PQE3.0,继而转化宿主工程菌株M15。经异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导表达产生hIL-22/His重组蛋白并纯化。重组蛋白经电泳分析和Westernblot验证。结果成功地克隆和构建了hIL-22/PQE3.0载体,转化的工程菌经过诱导表达18kd的hIL-22成熟链,利用亲和层析得到了纯化的重组蛋白。结论成功获得hIL-22/His重组蛋白,为下一步研究人IL-22在肿瘤细胞中的作用奠定了物质基础。     

融合蛋白DT389-hIL-13的克隆表达及其抗胶质瘤作用的初步研究

目的　构建白喉毒素N端 389个氨基酸 (DT389)与人白细胞介素 13(hIL 13)的融合蛋白DT389 hIL 13,并检测其生物学活性。方法　通过聚合酶链反应 (PCR)扩增得到hIL 13的cDNA ,将序列正确的hIL 13及DT389的cDNA片段串联插入表达载体pET30a ,构建表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,并对表达产物进行鉴定及初步纯化。该融合蛋白加入培养的U2 51胶质细胞中 ,应用MTS方法检测其对多型性胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用。结果　得到序列正确的融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,该质粒在大肠杆菌成功表达 ,经初步纯化后 ,十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺 (SDS PAGE)凝胶电泳及Western印迹分析表明 ,该融合蛋白对白喉毒素多克隆抗体及hIL 13多克隆抗体都有很好的免疫反应性 ,相对分子质量约为 5 5 0 0 0 ;进一步活性检测发现 ,该融合蛋白对多型性胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1的生长有较强的抑制作用 ,且作用存在剂量相关性 ,其半数抑制浓度(IC50 )约为 5× 10 -11mol/L。结论　成功构建了融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒 ,在细胞水平对表达产物进行了初步的活性检测 ,为进一步研制特异性的抗胶质瘤药物打下了基础。     

肿瘤血管导向肽与人突变IL-2融合蛋白的克隆、表达及生物学活性分析

目的获得具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽（NGR）融合表达的突变人IL-2蛋白.方法将突变人IL-2与NGR的融合基因重组到表达载体pET-22b（＋）并转化E.coli BL21（DE3）,测序正确后,IPTG诱导表达,并对产物进行纯化、复性和鉴定.结果目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%以上,Western blot分析显示纯化后的目的蛋白具有免疫结合活性,CTLL-2细胞增殖实验证明具有生物学活性.结论具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽融合表达的重组人IL-2蛋白可成功地克隆并表达,为进一步的肿瘤导向治疗打下基础.