靶向PCNA基因的小干扰RNA对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

目的： 研究小干扰RNA抑制PCNA基因表达后对鼻咽癌CNE2细胞株增殖及细胞周期的影响。方法: 利用体外合成法合成针对PCNA基因的小干扰RNA(siRNA)序列,应用脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞,实时定量PCR(real-time PCR) 和免疫组织化学法观察siRNA干扰后细胞中PCNA mRNA水平和PCNA蛋白表达,倒置相差显微镜观察转染前后CNE2细胞的生长变化,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期。结果: 在siRNA转染CNE2细胞后,细胞增殖受到抑制,蛋白表达不同程度降低,对PCNA mRNA水平的抑制达98.5%,细胞周期在G0/G1停滞。结论: siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应,抑制PCNA mRNA及蛋白表达,降低PCNA活性,抑制鼻咽癌细胞增殖,为鼻咽癌基因治疗提供了新的方法。     

MicroRNA-199a / b-3p 抑制三阴乳腺癌细胞增殖机制研究

目的:探讨microRNA-199a/b-3p(miR199)抑制三阴乳腺癌细胞增殖存活的作用机制。方法:在三阴乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-231转染miR199,荧光定量检测miR199表达量;MTT法检测转染miR199对三阴乳腺癌细胞存活率的影响;细胞周期分析检测,转染miR199对在乳腺癌细胞细胞周期的影响。结果:超表达miR199后,三阴乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-231的增殖率分别下降(41.02±2.34)%和(28.42±6.70)%,细胞周期均被阻滞在G1期。结论:miR-199a/b-3p抑制三阴乳腺癌增殖,具有抗三阴乳腺癌增殖药物开发的潜质。     

抑制氯通道阻抑鼻咽癌细胞周期和细胞增殖

目的:研究Cl^-通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩(RVD)、增殖及细胞周期分布中的作用。方法:活细胞图像分析低分化鼻咽癌细胞(CNE－2Z)RVD,用台盼蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖能力。用流式细胞仪测定细胞周期不同时相细胞百分率。结果:Cl^-通道抑制剂硝基苯丙胺基苯甲酸(NPPB)剂量依赖性抑制RVD和细胞增殖,100μmol/LNPPB明显阻抑细胞周期进程,使细胞停滞于G₁期,G₁期细胞百分率从54%提高到71%,但对细胞存活率没有显著性影响。结论:阻抑Cl^-通道可阻滞细胞于G₁期而抑制细胞增殖。提示Cl^-通道和RVD的激活是促进细胞从G₁期进入S期和维持增殖所必需的因素。     

氯化三乙基锡对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨氯化三乙基锡(triethyltin chloride,TETC)对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用MTT法检测0.5、1.0和2.0μmol/L TETC对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞作用24h和48h后细胞增殖的影响、采用细胞形态学观察及流式细胞术(FCM)方法检测0.5、1.0和2.0μmol/L TETC对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞作用48h后细胞增殖和细胞周期的影响。结果MTT法及细胞形态学观察均检测到0.5、1.0和2.0μmol/L TETC在体外均可抑制C6细胞增殖,C6细胞增殖率存在着剂量依赖性和时间依赖性降低趋势;TETC可将C6细胞阻滞在G0/G1期。结论TETC可抑制体外培养大鼠C6胶质瘤细胞增殖,其机制可能与C6细胞周期阻滞在G0/G1期有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯通过调控P53/miR-34a抑制鼻咽癌细胞的增殖

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖的影响,并以微小RNA-34a(miR-34a)为靶点探讨其作用机制。方法:不同浓度的EGCG处理CNE-2Z细胞,CCK-8法、Ed U染色法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期分布的改变;Western blot检测P53和Notch1蛋白水平的变化;real-time PCR检测miR-34a和Notch1 mRNA的表达。结果:EGCG处理后,CNE-2Z细胞的增殖受到明显抑制,克隆形成能力降低,细胞周期阻滞于G0/G1期,呈剂量依赖关系;随着EGCG浓度增高,P53和miR-34a的表达水平明显上调,而其下游Notch1 mRNA和蛋白的表达水平则明显下降。结论:EGCG可能通过调控P53/miR-34a/Notch1通路诱导细胞周期阻滞,抑制鼻咽癌细胞增殖。     

白藜芦醇对小鼠胚胎成纤维细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探讨白藜芦醇(Res)对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)增殖和细胞周期的影响及变化规律.方法:通过不同浓度(1～150 μmol/L)Res作用于增殖期的MEF,用MTT法检测72 h后各组细胞增殖变化,用流式细胞术检测并分析其细胞周期.结果:Res 1 μmo/L组A值明显高于对照组(P<0.05),Res 50 μmol/L和150 μmol/L组A值分别为0.196±0.055和0.185±0.034,均明显低于对照组(分别P<0.05,P<0.01),其细胞生长抑制率分别为14.0%和18.9%.细胞周期检测结果表明,Res 1 μmol/L组中G2/M期细胞占(14.82±0.49)%显著高于对照组(P<0.01).50 μmol/L和150 μmol/L组G0/G1期细胞所占比例分别为(59.61±6.03)%和(65.31±0.27)%均显著高于对照组(P<0.01).结论:Res对MEF增殖的影响,具有双向浓度依赖性,增殖和抑制增殖均与细胞周期调控有关,其中阻断G1期细胞进入S期是其抑制MEF增殖主要因素.     

NAC-1特异的siRNA增强紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞凋亡

目的: 探讨 NAC-1 (nucleus accumbens-1)基因特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)联合紫杉醇诱导人卵巢癌HO8910细胞凋亡的协同作用及其可能机制。方法: 测定不同浓度 NAC-1 基因特异的siRNA与紫杉醇单用或者合用对HO8910细胞增殖与凋亡的作用,设立阴性siRNA对照和空白对照。以实时荧光定量RT-PCR 检测NAC-1 mRNA表达水平、Western印迹法检测NAC-1蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)下游信号磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK),以MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡。结果: 单用 NAC-1 基因特异的siRNA作用48 h能抑制HO8910细胞NAC-1 mRNA和蛋白的表达,分别下调71.2%和80.5%,细胞周期被阻滞于G₁期,p-Akt和p-ERK蛋白水平分别下降43.7%和49.8%;作用72 h细胞增殖被抑制45.6%,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,差异显著(P<0.05)。 NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)与紫杉醇(2 μmol/L)联合作用于卵巢癌HO8910细胞72 h细胞凋亡率为(30.93±4.57)%,显著高于单用紫杉醇时的细胞凋亡率[(23.85±3.65)%],P<0.05。结论: 靶向抑制 NAC-1 基因表达能显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖,增强其对紫杉醇的敏感性,这与部分抑制EGFR下游信号途径有关。     

白藜芦醇对神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖的影响

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖变化规律和生长状况的影响。方法:通过不同浓度(0.15～500)μmol/LRes作用于SH-SY5Y,检测药物作用5d后各组细胞增殖率和细胞生长状态,同时通过增殖率曲线获得其半数生长抑制浓度(IC50)和杀伤浓度,并对各组细胞进行Hochest染色,检测其细胞凋亡情况。结果:Res5μmol/L组细胞增殖率为(117.00±15.30)%显著高于空白对照组(P0.05),15μmol/L组细胞增殖率为(31.33±2.89)%,50、150、500μmol/L组,细胞出现负增长。Res对SH-SY5Y的IC50为12.78μmol/L,细胞杀伤浓度(即增殖率为0%)为19.88μmol/L。Res50～500μmol/L各组内,部分细胞皱缩,突起减少或消失,并出现凋亡细胞。结论:Res在0.15～500μmol/L浓度范围内对SH-SY5Y的增殖影响存在浓度依赖性,并依次表现为促进增殖、抑制增殖和杀伤细胞三个方面效应。其中杀伤细胞效应与促进SH-SY5Y的凋亡启动相关。     

异丹叶大黄素下调膀胱癌细胞的细胞周期蛋白D1表达并诱导G0/G1细胞周期阻滞

 目的：探索异丹叶大黄素（ISO）抑制膀胱癌细胞侵袭、转移和增殖活性的机制。方法：以ISO作用于人源性膀胱癌UMUC3细胞后,倒置相差显微镜下观察并以ATP生物荧光法检测癌细胞增殖活性;以RT-PCR和Western blotting法检测细胞周期蛋白D1表达;以流式细胞术检测细胞周期的变化;细胞划痕法检测细胞迁移活性。结果：20 μmol/L浓度以上ISO可显著抑制UMUC3细胞的增殖,其IC50为(22.5±2.8) μmol/L。同时 UMUC3细胞的细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白水平均显著降低。以低浓度5 μmol/L ISO预处理UMUC3细胞后,与对照组（47.33%）进行比较,可分别在12 h（58.82％）和24 h（63.94％）显著诱导细胞G0/G1期阻滞（P<0.01）。细胞划痕法检测证实5 μmol/L ISO可显著抑制膀胱癌细胞的迁移活性。结论：ISO可抑制膀胱癌细胞增殖,下调细胞周期蛋白D1表达,诱导G0/G1细胞周期阻滞,抑制细胞的迁移能力。     

二吲哚吡啶基噻唑烷对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:探讨二吲哚吡啶基噻唑烷(DIIT)对肺癌A549细胞增殖的影响。方法:通过CCK-8法测定DIIT对肺癌A549细胞活力的影响;EdU/DAPI双染法观察细胞增殖情况;Western blot法检测DIIT对Akt和mTOR磷酸化及细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达水平的影响。结果:与DMSO对照组相比,用浓度为12.5、25、50和100 mg/L的DIIT处理A549细胞后,细胞的增殖情况分别下降12%、27%(P0.01)、33%(P0.01)及52%(P0.01);EdU阳性细胞相对数比DMSO对照组分别降低10%、21%(P0.05)、26%(P0.05)及34%(P0.01)。与DMSO对照组相比,DIIT可以抑制Akt及mTOR的磷酸化水平,抑制细胞周期蛋白CDK4及cyclin D1的表达水平(P0.01)。结论:二吲哚吡啶基噻唑烷抑制A549细胞增殖,其作用机制可能与Akt及mTOR的磷酸化水平下降及细胞周期蛋白表达受到抑制有关。     

Cl-在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中的作用

目的:研究鼻咽癌细胞的调节性容积回缩(RVD)及Cl^-在其中所起的作用。方法:活细胞图像分析低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)在细胞外低渗刺激时的细胞容积改变,用离子置换法和通道阻断法阐明Cl^-在RVD中所起的作用。结果:细胞外低渗刺激使细胞膨胀并诱发RVD。在160-230mOsmol/L范围内,RVD与细胞膨胀程度正相关。用葡萄糖酸取代灌流液Cl^-时RVD增强,细胞内Cl^-耗竭时RVD消失。氯通道阻断剂阻抑RVD,但不同的阻断剂对RVD的阻抑率有明显差异。结论:Cl^-是CNE-2Z细胞RVD的关键离子,Cl^-通道激活,Cl^-外流是RVD的主要机制。     

ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用

目的:探讨ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用。方法:采用不同浓度二甲双胍处理低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测ClC-3氯通道蛋白表达,全细胞膜片钳技术检测细胞氯电流。构建高表达ClC-3氯通道蛋白的质粒pEZ-M03-ClC-3转染CNE-2Z细胞,流式细胞术检测ClC-3氯通道对细胞周期分布的影响。结果:5、10和20 mmol/L浓度的二甲双胍均可有效抑制CNE-2Z细胞的活力。10 mmol/L二甲双胍可阻抑CNE-2Z细胞周期于G0/G1期,并抑制CNE-2Z细胞氯电流及ClC-3氯离子通道蛋白的表达。ClC-3氯通道蛋白高表达可逆转二甲双胍对CNE-2Z细胞周期分布的影响。结论:二甲双胍抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞周期进程可能与抑制ClC-3氯通道功能和蛋白表达有关。     

EB病毒LMP1表达对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期分布的影响

目的:观察EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的作用。方法:用免疫组化(LSAB)法检测LMP1蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的增殖能力;用流式细胞术检测细胞周期的分布。结果:表达LMP1的鼻咽癌细胞系L-CNE1的OD值明显高于LMP1阴性的鼻咽癌细胞系V-CNE1和CNE1(P＜0.001)。L-CNE1细胞系的G₁期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加,与V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著性差异(P＜0.001)。而V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率则无明显差异(P＞0.05)。结论:EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞系细胞周期分布改变和增殖能力增强。     

姜黄素类似物B67诱导细胞凋亡和G2/M期 阻滞增强对鼻咽癌辐射抗拒细胞的抑制作用

目的: 研究姜黄素类似物B67对鼻咽癌(NPC)辐射抗拒细胞(CNE-2R)活性和增殖的作用,及其对细胞周期和凋亡的影响。方法: 采用MTT和平板克隆形成实验检测B67对CNE-2R细胞及其母细胞CNE-2活性和增殖的抑制作用,采用荧光显微镜和流式细胞仪观测凋亡细胞的形态学变化、细胞凋亡百分率、细胞周期分布和线粒体膜电位的改变,采用裸鼠皮下成瘤实验检验B67作用于CNE-2R细胞后的成瘤性。 结果: B67作用于NPC细胞24、48和72 h后,MTT检测细胞活性的IC₅₀分别为3.96、2.59和0.89 μmol/L(CNE-2R)以及8.84、3.55和1.10 μmol/L(CNE-2),B67作用48 h后平板克隆形成实验检测NPC细胞增殖的IC₅₀分别为0.55 μmol/L(CNE-2R)和0.73 μmol/L(CNE-2),B67作用24 h后NPC细胞的G₂/M期比例的上升分别为5.32%上升到40.01%(CNE-2R)和9.07%上升到15.73%(CNE-2),B67作用48 h后NPC细胞凋亡率的改变分别为5.49%上升到38.06%(CNE-2R)和4.99%上升到35.74%(CNE-2),B67作用48 h后NPC细胞线粒体膜电位的下降分别为66.76%(CNE-2R)和72.09%(NE-2),B67作用24 h后NPC细胞在裸鼠皮下的成瘤率分别为0%(CNE-2R)以及低浓度组100%、高浓度组0%(CNE-2)。 结论: 姜黄素类似物B67可较特异地诱导CNE-2R细胞G₂/M期阻滞和促进细胞凋亡和线粒体膜电位的改变,引起裸鼠皮下成瘤性的差异,以增强其对鼻咽癌辐射抗拒细胞的抑制作用。     

Control of cell proliferation by cell volume alterations in rat C6 glioma cells

K+ and Cl- channels are involved in regulating the proliferation of a number of cell types. Two main hypotheses have been proposed to explain the mechanism by which these channels influence cell proliferation: regulation of membrane potential and regulation of cell volume. In order to test these hypotheses, we measured, under different experimental conditions, the volume, membrane potential and rate of proliferation of C6 glioma cells. Cells cultured in control medium for 1-4 days were compared with cells cultured for the same period of time in the presence of broad spectrum channel blockers: tetraethylammonium, 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) and Cs+, in hypertonic media (29% increased osmolarity with NaCl, KCl or sucrose), in hypotonic medium (23% decreased osmolarity with H2O) or in the presence of the specific channel blockers, i.e. mast cell degranulating peptide, charybdotoxin or chlorotoxin. In all of these conditions, we observed a close correspondence between the rate of proliferation and the mean cell volume. The proliferation decreased when volume increased. Moreover, whereas control cells were flattened, spindle-shaped, bipolar or multipolar, cells cultured in media supplemented with NPPB, KCl or CsCl were round with few processes. Of the agents tested, only KCl and Cs+ depolarized the cells. These results show that alterations of the rate of proliferation by K+ and Cl- channel blockers or anisotonia are closely related with changes in cell volume or form but are not correlated with changes in membrane potential.     

低氧-复氧对人鼻咽癌细胞增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响

目的: 研究细胞外微环境低氧-复氧对人鼻咽癌细胞(CNE-2Z)增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响。方法: 以混合气体(5% CO₂, 95% N₂, O₂<0.1%)置换法建立体外低氧培养模型;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期分布;同质黏附实验和细胞-基质黏附实验检测细胞黏附能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果: (1) 低氧24 h后抑制CNE-2Z细胞增殖(P<0.01),复氧后细胞快速增殖,在复氧第5 d A值与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(2) 低氧24 h后细胞阻滞于G₁期(P<0.01),复氧后G₁期阻滞得到快速解除,在复氧24 h细胞周期分布与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)低氧24 h后细胞的同质黏附能力下降(P<0.01)而细胞-基质黏附能力无明显改变(P>0.05),细胞侵袭能力降低(P<0.01);复氧24 h细胞同质黏附能力恢复至常氧对照组水平(P>0.05),而细胞-基质黏附能力(P<0.01)和细胞侵袭能力较常氧对照组显著增加(P<0.01)。结论: 鼻咽癌细胞能耐受微环境低氧的不利影响;低氧环境下存活的鼻咽癌细胞产生的适应性变化赋予肿瘤更强的增殖和转移潜能,从而促进肿瘤细胞的恶性演进。     

受体酪氨酸激酶Axl高表达促进鼻咽癌临床进展

目的:探讨受体酪氨酸激酶anexelekto(Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表达,分析Axl蛋白表达与NPC患者临床参数的相关性。常规培养NPC细胞,免疫荧光法检测不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表达情况。应用Axl特异性抑制剂TP-0903处理CNE1和C666-1细胞,CCK-8实验检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞周期的分布,q PCR检测Axl和增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达,Western blot检测Axl及p-Axl蛋白的表达。结果:Axl蛋白定位于胞膜和胞质。NPC中Axl高表达阳性率显著高于鼻咽黏膜慢性炎(P0.01)。Axl高表达与患者年龄、性别及M分期无关,与临床分期、T分期和N分期呈正相关(P0.05)。Axl在高分化CNE1细胞中低表达,在低分化CNE2Z细胞和未分化C666-1细胞中表达水平明显增高。TP-0903呈浓度和时间依赖性抑制NPC细胞的活性,2 nmol/L TP-0903即具有显著抑制效应,能阻滞细胞周期于G0期,在降低Axl活性的同时也显著抑制PCNA的表达。结论:Axl高表达可促进NPC的临床进展;TP-0903显著抑制NPC细胞的增殖,提示Axl可能在NPC靶向治疗中具有一定的价值。     

Calreticulin通过诱导细胞EMT促进鼻咽癌迁移和侵袭

目的:观察钙网蛋白(calreticulin,CRT)在鼻咽癌组织中的表达并分析其临床病理学意义,揭示其对鼻咽癌CNE2细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:S-P免疫组化法检测CRT在52例鼻咽癌组织和57例鼻咽部良性病变组织中的表达情况,并分析其临床病理学意义;构建特异性干扰CRT基因的小干扰RNA干扰载体,瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,观察CRT低表达对CNE2细胞形态的影响;Transwell迁移和侵袭实验检测CRT低表达对CNE2细胞迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测CRT低表达对上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、转化生长因子-β(TGF-β)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)等EMT相关蛋白表达的影响。结果:CRT在鼻咽癌组织中的阳性表达率为82.69%(43/52),在鼻咽部良性病变组织的阳性表达率为19.29%(11/57),CRT在鼻咽癌组织中表达显著增高(P0.05);CRT的阳性表达率与鼻咽癌分期及淋巴结转移呈正相关(P0.05)。敲降CRT呈低表达后,CNE2细胞由梭形演变为扁平和鹅卵石样,且细胞排列紧密,细胞的迁移侵袭能力减弱(P0.05)。敲降CRT呈低表达后,E-cadherin表达显著增高,vimentin、TGF-β以及MMP-9蛋白的表达降低(P0.05)。结论:Calreticulin在鼻咽癌组织中表达显著增高,且与鼻咽癌临床分期及淋巴结转移呈正相关。Calreticulin可诱导鼻咽癌CNE2细胞发生EMT,进而促进鼻咽癌的迁移和侵袭。     

Hypotonicity stimulates translocation of ICln in neonatal rat cardiac myocytes

 Cell volume expansion stimulates the efflux of solutes, including the amino acid taurine, to accomplish a regulatory volume decrease (RVD). One protein that may play a role in taurine efflux is the cytosolic protein ICln. In rat neonatal cardiac myocytes under isotonic conditions, ICln is found predominantly (greater than 90%) in the cytosol. However, after cell volume expansion by exposure to hypotonic medium, ICln rapidly translocates to the particulate fraction (the Triton X-114-insoluble fraction). After 2 min in hypotonic medium the percentage of ICln in the particulate fraction increases to 30%, 46% at 5 min, 40% at 10 min, and 25% at 30 min. The time course of this response is similar to that of hypotonicity-stimulated taurine efflux. Hypotonicity-stimulated taurine efflux as well as ICln translocation parallel the reduction in medium osmolarity. As osmolarity decreases, taurine efflux and ICln movement increase. The movement of ICln from the particulate back to the cytosolic fraction is accelerated when volume-expanded cells are returned to isotonic medium. When ICln is analyzed under non-denaturing conditions, a dimer is detected in the particulate fraction of volume-expanded cells, along with the monomer. This dimer is not detected in the cytosol. Treatment of the particulate fraction from volume-expanded cells with the lyotropic agent KSCN caused release of ICln but not Na-K-ATPase into the soluble fraction, indicating that translocated ICln associates with membranes in the particulate fraction rather than inserting into them. Received: 31 October 1997 / Received after revision and accepted: 23 March 1998