健脾理气方对人乙型肝炎病毒转基因小鼠不同时相血清黄曲霉毒素B_1—白蛋白加成物水平的影响

为了探讨HBV与AFD_1协同致肝癌及健脾理气方防治肝癌的机理,预先予HBV转基因小鼠灌服健脾理气方2.5g/kg.wt,qd×15d,再予AFB1 1mg/kg.wt,I.P.,用RIA法测经治疗和未经治疗转基因小鼠及正常小鼠7个时相血清AFB_1—白蛋白加成物浓度。HBV转基因小鼠较正常小鼠易于聚积AFB_1毒性。高峰相加成物水平显著升高,24h相仍维持较高水平。健脾理气方能显著降低该加成物水平,在24h时相使其降至正常水平,该结果提示,HBV与AFB_1协同致肝癌是由于HBV致肝损伤,对毒性致癌物清除障碍所致,健脾理气方能通过加速毒性致癌物清除而抑制肿瘤发生。     

HBsAg和HBcAg融合表达质粒对HBV转基因小鼠的体液免疫治疗效应

目的观察融合表达质粒pcDNA3．1-SC对HBV复制和表达的抑制效果。方法 构建融合表达质粒pcDNA3．1-SC，以100μg肌肉接种C57，BL／6 HBV DNA转基因小鼠，2、4周后各加强免疫1次。然后动态检测小鼠血清抗-HBs、抗-HBc的诱生，以及肝组织HBsAg、HBcAg和血清HBV DNA的消长情况。结果接种后4、8、12周，小鼠血清抗-HBs阳转率分别达到55％、67％和33％；而抗-HBc阳转率低于20％；同时，与接种前相比，肝组织内HBsAg、HBcAg表达和血清HBV DNA水平呈逐渐减弱的趋势，在接种后8周，有1／3的小鼠已不能检出。结论融合表达质粒pcD—NA3．1-SC能够在一定程度上抑制转基因小鼠体内的HBV DNA复制和抗原表达，提示了研制乙型肝炎治疗性DNA疫苗的可能性。     

原发性肝癌组织P16蛋白的缺失与HBV感染

目的研究Ｐ１６蛋白缺失与原发性肝癌发生发展的关系以及ＨＢＶ感染与Ｐ１６蛋白缺失的相关性．方法用免疫组化技术（ＬＳＡＢ法）检测７０例原发性肝癌组织标本中的Ｐ１６蛋白和ＨＢｓＡｇ．结果有６０６％（４０／６６）的肝细胞癌（ＨＣＣ）和７５０％（１／４）的胆管细胞癌（ＣＣＣ）Ｐ１６蛋白缺失；Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ级（按Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ标准）ＨＣＣＰ１６蛋白缺失率分别为００％（０／１），４４１％（１５／３４），８２１％（２３／２８）和６６７％（３／４），组间差异显著（Ｐ＜００５）．在有癌旁肝组织的４８例标本中，癌组织Ｐ１６蛋白阴性率（７２６％）明显高于癌旁肝组织（４１２％，Ｐ＜００５）．有６２５％（３０／４８）的ＨＣＣ癌旁肝组织ＨＢｓＡｇ阳性．ＨＢｓＡｇ阳性病例与阴性病例的Ｐ１６阴性率分别为７３３％（２２／３０）和６６７％（１２／１８），差异无显著性（Ｐ＞００５）．结论Ｐ１６蛋白缺失与原发性肝癌相关，与肝癌的恶性发展关系密切，可能对预后有重要影响．ＨＢＶ感染与Ｐ１６蛋白缺失无明显相关性．     

肝癌分子流行病学的研究

肝癌分子流行病学的研究周汉高顾公望Ｓｕｂｊｅｃｔｈｅａｄｉｎｇｓｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ／ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ；ｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ／ｅｔｉｏｌｏｇｙ；ｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ...     

肝病患者D-二聚体检测的临床意义

肝病患者Ｄ－二聚体检测的临床意义李彩靳淑玲肖岩Ｓｕｂｊｅｃｔｈｅａｄｉｎｇｓｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ；ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣ；ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ；ｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ｆｉｂｒｉｎｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ...     

肝癌中cyclinD1扩增与HBV感染及病理学的关系

目的探讨癌基因ｃｙｃｌｉｎＤ１在肝癌发生发展中的作用以及与ＨＢＶ感染和临床病理之间的关系．方法取手术切除的肝细胞癌标本,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的方法对ｃｙｃｌｉｎＤ１和ＣＤＫ４癌基因以及ＨＢＶ的感染状态进行了检测,切片同时行病理检查．结果肝癌３９例中９例ｃｙｃｌｉｎＤ１存在２～３０倍的扩增（２３７％）,其中１例检出重组杂交带;３７例中５例（１３５％）有ＣＤＫ４的扩增;ＨＢＶＤＮＡ在肝癌组织中检出的阳性率为９４７％,ＨＢＶＤＮＡ整合率为７４４％．相关分析发现,ｃｙｃｌｉｎＤ１的扩增与ＣＤＫ４扩增,ＨＢＶＤＮＡ整合,肿瘤的分化高低和肿块大小等之间有相关关系,相关系数ｒ分别为０５１,０３１,０３９和０５５,全部Ｐ＜００５．结论ｃｙｃｌｉｎＤ１的扩增与ＨＢＶＤＮＡ的整合密切相关,并在肝癌的恶化进展中起着重要作用．     

肝病患者红细胞cr1基因组密度多态性与红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的相关性

目的为了研究不同肝病患者人群中红细胞ｃｒ１基因组密度多态性与红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的相关性．方法乙型肝炎患者４８例，肝硬变４９例，肝细胞性肝癌９４例及正常对照８０例．采用ＰＣＲ加ＨｉｎｄⅢ酶切技术测定红细胞ｃｒ１基因组密度多态型（ＨＨ型、ＨＬ型、ＬＬ型），采用肿瘤红细胞花环试验测定红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力．结果在不同人群中，ＨＨ型红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力明显大于ＨＬ型红细胞，而ＨＬ型红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力明显大于ＬＬ型红细胞．在相同基因型人群中，正常人红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力显著高于乙型肝炎、肝硬变和肝癌患者．结论红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力与ｃｒ１基因组密度多态型别有关，同时也与后天获得性影响因素有关．     

慢性乙型肝炎患者白细胞介素-18、转化生长因子-β1、HBV DNA与肝脏损伤的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血IL-18、转化生长因子(TGF)-β1、HBVDNA与肝功能损伤及肝纤维化发生发展的关系.方法 67例慢性乙型肝炎患者作为实验组,20例健康体检者作为健康对照组.双抗体夹心ELISA法及荧光定量PCR法检测外周血IL-18、TGF-β1和HBV DNA.48例患者行肝穿刺组织学检查.统计学处理采用方差分析,对方差不齐者采用秩和检验;各指标相关性采用偏相关分析.结果 乙型肝炎轻、中、重度及肝炎肝硬化组血清TGF-β1、IL-18及ALT、Tbil水平均不同程度高于健康对照组(P<0.01),IL-18、TGF-β1水平随CHB程度加重逐渐升高,TGF-β1各组间差异均有统计学意义(P<0.01),尤以肝硬化组升高显著.高病毒量组与低病毒量组ALT、Tbil比较差异无统计学意义.但与对照组比较差异均有统计学意义(F=10.970,F=7.528;F=14.698,F=13.395;均P<0.05);TGF-β1水平随纤维化分期SO～4逐步升高,除S3与S4比较无差异外,其余两两比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05).IL-18仅S1期与其他各期有差异,HBV DNA在各期间均差异无统计学意义;偏相关性分析显示IL-18与ALT、Tbil呈正相关(r=0.480 6,r=0.5047,P<0.01),HBV DNA与lL-18、TGF-β1、ALT、Tbil无相关性.结论 血清IL-18、TGF-β1水平可作为判断肝脏损伤严重程度的指标.血清TGF-β1与肝炎肝硬化的程度密切相关.HBV DNA与肝脏损伤及纤维化关系不大.     

Hepatic aflatoxin B1‐DNA adducts and TP53 mutations in patients with hepatocellular carcinoma despite low exposure to aflatoxin B1 in southern Japan

Background & aims: Hepatitis B or C virus infection is considered to be the main cause of hepatocellular carcinoma (HCC) in Japan. Aflatoxin B1 (AFB1) is a carcinogen associated with HCC in regions with high exposure. Mutations in codon 249, exon 7 are a hallmark of AFB1 exposure. Therefore, to clarify the role of AFB1 in hepatocarcinogenesis, we examined AFB1‐DNA in liver tissue and sequenced TP53 in Japanese patients with HCC. Methods: Hepatocyte AFB1‐DNA adducts were determined immunohistochemically and direct sequencing of TP53 was done to determine mutations in 188 of 279 patients who underwent hepatic resection for HCC. We assessed hepatitis C virus antibodies (HCV Ab) and HBSAg expression; patients without either were defined as having non‐B non‐C hepatocellular carcinoma (NBNC HCC). Results: AFB1‐DNA adducts were detected in hepatocyte nuclei in 18/279 patients (6%), including13/83 patients (16%) with NBNC HCC and 5/51 patients (10%) expressing hepatitis B surface antigen. None of the patients with HCV Ab (n=136) were positive for AFB1‐DNA. The incidence of the G–T transversion and mutations in exon 7 of TP53 in patients with AFB1‐DNA adducts were significantly higher in patients with than in patients without AFB1‐DNA adducts. All three patients with the codon 249 AGG–AGT mutation had AFB1‐DNA adducts. Conclusion: Although exposure to AFB1 is thought to be low in Japan, it is still associated with hepatocarcinogenesis, particularly in NBNC HCC and hepatitis B individuals.     

乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测

目的 检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA),评价其相关的影响因素和临床意义.方法 共观察57例乙型肝炎患者,其中轻度慢性乙型肝炎患者26例,重型乙型肝炎患者31例.患者入院后行PT、肝功能、肝炎病毒血清标志物等常规检测,并进行总HBV DNA和HBV cccDNA检测.Logistic逐步回归分析影响血清HBVcecDNA检出率的相关因素.结果重型乙型肝炎组13份血清标本HBV cccDNA为阳性,轻度慢性乙型肝炎组仅1份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量为1.25×103～4.88×104拷贝/mL,两组患者血清HBV cccDNA检出率差异有统计学意义(P=0.0014).血清HBV cccDNA检测诊断重型乙型肝炎患者的灵敏度和特异度分别为41.94%和96.15%.Logistic逐步回归分析显示,血清HBV ccvDNA的检出率与PT有关(X<'2>=7.2192,P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清总HBV DNA、TBil和ALT水平无相关性.结论 部分乙型肝炎患者特别是重型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,血清HBV cccDNA的检出可作为支持重型乙型肝炎诊断的指标之一.     

慢性乙型肝炎患者HBV DNA自发性下降的流行病学特点

目的 了解HBV DNA水平自发性下降在慢性乙型肝炎(CHB)患者中的发生率、分布特征及其影响因素.方法 应用临床流行病学调查方法研究315例CHB或肝硬化(LC)患者HBVDNA自发性下降的发生率、人口学特点及诊断分布情况,并采用Logistic回归分析HBV DNA自发性下降的影响因素.结果 在12周内发生HBV DNA自发性下降的患者为171例,占54.3%,其中,HBV DNA降至3 lg拷贝/mL以下的患者为61例.占19.4%.分层研究显示青年组与少年组患者HBV DNA自发性下降率分别为58.6%(116/198例)和25.0%(2/8例),前者高于后者(X2=2.956,P=0.048);病情重的比病情轻的患者更易发生HBV DNA自发性下降,两两比较,有差异组的均X2＞3.84,P＜0.05,其中慢性重型肝炎的下降率最高,达78.7%(48/61例).重叠HEV感染与单纯HBV感染患者HBV DNA自发性下降率分别为75.0%(21/28例)和51.8%(146/282例),前者高于后者(X2=5.530,P=0.019).ALT＞400 U/L与ALT≤400 U/L的患者HBV DNA自发性下降率分别为61.8%(102/165例)和46.0%(69/150例),前者高于后者(X2=7.922,P=0.005);TBil＞200 μmol/L与TBil≤200 μmol/L的患者HBV DNA自发性下降率分别为68.7%(79/115例)和46.0%(92/200例),前者高于后者(X2=15.155,P:0.000).多因素Logistic回归分析显示,慢性重型肝炎、ALT＞400 U/L、TBil＞200 μmol/L 是CHB或LC患者发牛HBV DNA自发性下降的影响因素(均OR＞1,P＜0.05).结论 HBV DNA水平自发性下降足CHB或LC患者自然病程进展(免疫清除期)中的常见现象.患者病情严重、ALT高、TBil高,则易发生HBV DNA自发性下降.     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）与血清HBV DNA之间的相关性及其与临床的关系。方法 78例慢性乙型肝炎患者入选本研究。肝组织β- globinDNA、HBV cccDNA和HBV tDNA采用实时荧光定量PCR方法检测,平均每个肝细胞HBV cccDNA和HBV tDNA含量（拷贝/cell）=HBV cccDNA（实测值）/β-globin DNA（实测值）和HBV tDNA（实测值）/β3-globin DNA（实测值）,肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA含量的计算单位定义为log₁₀拷贝/10⁶cell;采用实时荧光定量PCR、ELISA法检测血清HBVDNA和HBV标志物;采用免疫组织化学方法检测肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达。统计分析采用pearson相关分析及t检验。结果 （1）肝组织HBV cccDNA与HBV tDNA定量呈正相关（r=0.696,P<0.001）;肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.304,P<0.01）;肝组织HBV tDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.341,P<0.01）;（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义和（P均>0.05）;（3）肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义（P>0.05）;（4）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量与HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者比较差异均无统计学意义（均P>0.05）;（5）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA以及血清HBV DNA三者与肝脏炎症活动度及纤维化程度均无显著相关性（P>0.05）。结论 （1）血清HBV DNA定量结果并不一定能完全反映患者肝组织中HBV cccDNA和HBV tDNA含量,尤其在血清HBV DNA<500拷贝/mL时,肝组织中仍存在HBV cccDNA和HBV tDNA,且含量大小不等。（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性或者HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量均明显高于阴性患者;而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量均没有显著差异;（3）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA均没有显著差异;（4）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA及血清HBV DNA与肝脏炎症活动度和纤维化程度均无显著相关性。     

Hepatitis B virus x gene and cyanobacterial toxins promote aflatoxin B1-induced hepatotumorigenesis in mice

AIM: To assess the combinative role of aflatoxin B1 (AFB1), cyanobacterial toxins (cyanotoxins), and hepatitis B virus (HBV) x gene in hepatotumorigenicity. METHODS: One-week-old animals carrying HBV x gene and their wild-type littermates were intraperitoneally (ip) injected with either single-dose AFB1 [6 mg/kg body weight (bw)], repeated-dose cyanotoxins (microcystin-LR or nodularin, 10μg/kg bw once a week for 15 wk), DMSO (vehicle control) alone, or AFB1 followed by cyanotoxins a week later, and were sacrificed at 24 and 52 wk post-treatment. RESULTS: AFB1 induced liver tumors in 13 of 29 (44.8%) transgenic mice at 52 wk post-treatment, significantly more frequent than in wild-type mice (13.3%). This significant difference was not shown in the 24-wk study. Compared with AFB1 exposure alone, MC-LR and nodularin yielded approximately 3-fold and 6-fold increases in the incidence of AFB1-induced liver tumors in wild-type animals at 24 wk, respectively. HBV x gene did not further elevate the risk associated with co-exposure to AFB1 and cyanotoxins. With the exception of an MC-LR-dosed wild-type mouse, no liver tumor was observed in mice treated with cyanotoxins alone at 24 wk. Neither DMSO-treated transgenic mice nor their wild-type littermates had pathologic alterations relevant to hepatotumorigenesis in even up to 52 wk. CONCLUSION: HBV x gene and nodularin promote the development of AFB1-induced liver tumors. Co-exposure to AFB1 and MC-LR tends to elevate the risk of liver tumors at 24 wk relative to exposure to one of them. The combinative effect of AFB1, cyanotoxins and HBVx on hepatotumorigenesis is weak at 24 wk.     

HBsAg DNA疫苗诱导小鼠体液免疫及抑制转基因鼠表面抗原的产生

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流式细胞光度术研究大鼠肝癌及癌前病变DNA的变化

目的用流式细胞光度术（ＦＣＭ）探讨大鼠肝癌和癌前病变ＤＮＡ变化的意义．方法取正常大鼠、肝硬变、非典型增生和肝癌大鼠肝脏组织块，制成单细胞悬液，做ＦＣＭ分析．结果从正常肝组织到肝脏的各级病变，二倍体细胞所占的百分比逐渐增加（７１０±２２，７５０±２８，７６０±４４，８００±３９，Ｐ＜００５），四倍体细胞百分比则下降（１５０±１４，１４０±１０，１２０±２４，９９±１７，Ｐ＜００５），Ｓ期比率（％）升高（８４±１４，１００±１０，１０８±２５，１１３±１８，Ｐ＜００５）．在肝癌大鼠中５０％为异倍体．结论ＦＣＭ分析对肝癌前病变及肝癌的早期诊断有一定的临床意义．     

PCR检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义

目的探讨急、慢性乙型肝炎及与ＨＢＶ感染相关的肝硬变和肝癌患者血清ＨＢＶＤＮＡ的临床意义．方法应用ＰＣＲ技术检测不同ＨＢＶ感染２０５例，患者血清ＨＢＶＤＮＡ，并与正常人２０例作比较．结果ＨＢＶ感染患者２０５例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性率为６９３％，慢性乙肝、乙肝后肝硬变和肝癌患者的阳性率分别为７６４％，７１９％和７００％，显著高于急性乙肝患者２１７％的阳性率（Ｐ＜００１）；ＨＢｅＡｇ（＋）患者血清ＨＢＶＤＮＡ阳性率为９３６％，显著高于ＨＢｅＡｇ（－）抗ＨＢｅ（＋）／（－）和ＨＢｓＡｇ（－）患者的阳性率（４５６％，２５０％和１２５％，Ｐ＜００１）；血清ＨＢＶＤＮＡ阳性和阴性两组患者的血清ＡＬＴ水平无明显差异（Ｐ＞００５）．结论血清中ＨＢＶＤＮＡ持续存在可能与乙型肝炎的慢性化有关，而与ＨＢＶ感染患者的肝损伤无明显关系