双眼形觉剥夺对大鼠视皮层神经元电生理特性的影响

目的 研究形觉剥夺对发育过程中视皮层神经元突触电生理学影响,探索哺乳动物视觉发育可塑性的细胞水平机制。方法正常组和双眼形觉剥夺组Wistar大鼠61只,制作脑片并获得膜片钳全细胞记录。记录视皮层神经元的突触后电流(Postsynptre currents,PSCs)和诱发长时程增强(Lorg-term potentiation,LTP)。电生理记录结束后对所记细胞进行免疫组化染色。结果①双眼形觉剥夺组无反应型PSCs比例显著高于正常组(P<0.01);多突触反应型PSCs比例正常组显著高于双眼形觉剥夺组(P<0.01)。②双眼形觉剥夺组与正常组间相比,输入阻抗显著增高(P<0.01),静息电位较为去极化(P<0.01),EPSCs峰值显著降低(P<0.01)。③形觉剥夺组LTP诱发率显著低于正常组(P<0.05)。双眼形觉剥夺组组4周龄、5周龄的LTP增值显著高于正常组同周龄时(P<0.01,P<0.05)。结论①双眼形觉剥夺影响了静息突触向功能性突触的转化和神经网络的成熟。②双眼形觉剥夺可以在一定程度上影响神经元的突触传导功能。③双眼形觉剥夺在一定程度上降低视皮层神经元的可塑性,但可能保持了神经元对适宜刺激的反应能力。     

视觉发育可塑性关键期后弱视大鼠视皮质c-fos的表达

目的 观察双眼形觉剥夺性弱视成年大鼠光照刺激诱导视皮质神经元c-fos表迭情况,探讨已过视觉发育可塑性关键期的弱视大鼠视皮质内视觉可塑性的存留程度.方法 14日龄SD大鼠共21只,随机分为无光照弱视组8只、光照弱视组8只和正常对照组5只,弱视组行双侧眼睑缝合术建立双眼形觉剥夺性弱视模型.饲养至100日龄后光照弱视组和对照组暴露于外界光线中0.5 h,无光照弱视组不接触光线.取材后采用Nissl染色法及电镜观察3组视皮质神经元的形态改变,并用免疫组化技术检测c-fos蛋白表达情况.结果 ①弱视组视皮质神经元比正常组体积变小:②超微结构显示:弱视组视皮质出现早期类凋亡改变的神经元;③光照弱视组视皮质内Ⅱ～Ⅳ层各层中c-fos免疫刚性神经元密度明显高于另外两组(P＜0.05).结论 双眼形觉剥夺性弱视成年大鼠视皮质经光照刺激诱导c-fos表达增加,提示已过视觉发育敏感期成年大鼠的视皮质仍存留一定程度的视觉可塑性.     

视觉发育可塑性关键期后弱视大鼠视皮质c-fos的表达

目的 观察双眼形觉剥夺性弱视成年大鼠光照刺激诱导视皮质神经元C-los表达情况，探讨已过视觉发育可塑性关键期的弱视大鼠视皮质内视觉可塑性的存留程度。方法 14日龄SD大鼠共21只，随机分为无光照弱视组8只、光照弱视组8只和正常对照组5只，弱视组行双侧眼睑缝合术建立双眼形觉剥夺性弱视模型。饲养至100日龄后光照弱视组和对照组暴露于外界光线中0．5h，无光照弱视组不接触光线。取材后采用Nissl染色法及电镜观察3组视皮质神经元的形态改变，并用免疫组化技术检测C-fos蛋白表达情况。结果 ①弱视组视皮质神经元比正常组体积变小：②超微结构显示：弱视组视皮质出现早期类凋亡改变的神经元；③光照弱视组视皮质内Ⅱ～Ⅳ层各层中C-fos免疫刚性神经元密度明显高于另外两组（P〈0．05）。结论 双眼形觉剥夺性弱视成年大鼠视皮质经光照刺激诱导c-los表达增加，提示已过视觉发育敏感期成年大鼠的视皮质仍存留一定程度的视觉可塑性。     

年龄和视觉经验对大鼠视皮层突触功能发育的影响

目的 研究大鼠视觉发育可塑性关键期视皮层Ⅱ-Ⅲ层神经元的电学特性变化及其与大鼠生理年龄及视觉经验的关系,探索视皮层经验依赖性可塑性的突触和细胞机制。方法制备0～25 d龄大鼠视皮层脑片,利用膜片钳全细胞记录法记录Ⅱ-Ⅲ层神经元的突触后电流(Post synaptic currents ,PSCs)。结果①随着大鼠天龄增大,无反应型PSCs迅速减少,P0-5d组、P6~10d组与P11～25d组之间相差非常显著(P<0.01),而各组内无显著差异。多突触型PSCs随天龄增大逐渐增多。②细胞的静息电位、输入阻抗、PSCs峰值、10％～90％上升及下降时间、半波宽随大鼠天龄增大呈规律性变化,各组差异主要体现在P0~5d组与其它组之间(P<0.05),而P11～14d组与P15~25d组间差异不显著(P>0.05)。结论①视皮层细胞的静息电位、输入阻抗、PSCs反映不同发育阶段视皮层突触功能特性。②视皮层突触的形成是一个程序化过程,年龄和视觉经验共同参与突触成熟,但在正常大鼠视觉发育可塑性关键期内,年龄可能是决定性因素,而睁眼后形觉刺激参与突触修饰、稳定和固化。     

不同时限斜视性弱视大鼠视皮质c-fos表达的研究

目的 研究斜视性弱视大鼠在视觉发育可塑关键期早中末期以及成年后视觉发育情况及可塑性的存留程度。方法13日龄SD大鼠共40只,随机分为2组,分别为：正常组（N）20只,斜视性弱视组 (MS)20只; MS组所有大鼠行单侧眼外直肌切除术,建立斜视性弱视大鼠模型。每一组分别在视觉发育关键期早期（P25）,中期（P35）,末期（P45）以及成年后（P120）取材。取材前做F-VEP检测,黑箱饲养24小时,曝光半小时处理后经左心室主动脉灌注固定取材,切取各组大鼠脑组织视皮质17区,应用c-fos蛋白免疫组化染色分别比较单眼斜视弱视大鼠与正常大鼠视皮质光刺激诱导c-fos蛋白表达的阳性神经元的差异。结果 各年龄组斜视组大鼠斜视眼N1P1、P1N2振幅与未剥夺眼相比大幅下降（P＜0.05）;视觉发育可塑性关键期早期和中期单眼斜视弱视大鼠与正常大鼠视皮质内光刺激诱导c-fos蛋白表达的阳性神经元差异不具有统计学意义（P＞0.05）;视觉发育可塑性关键期末和成年后单眼斜视弱视大鼠较正常大鼠视皮质光刺激诱导c-fos蛋白表达的阳性神经元多（P＜0.05）。结论　c-fos蛋白在成年弱视大鼠视皮质内神经元的表达增加,提示已过视觉发育敏感期成年弱视大鼠的视皮质神经元仍存留一定程度的视觉可塑性。     

不同时限斜视性弱视大鼠视皮质c—los表达的研究

目的研究斜视性弱视大鼠在视觉发育可塑关键期早中末期以及成年后视觉发育情况及可塑性的存留程度。方法13日龄SD大鼠共40只,随机分为两组,正常组（N）20只,斜视性弱视组（MS）20只;MS组所有大鼠行单侧眼外直肌切除术,建立斜视性弱视大鼠模型。每组分别在视觉发育关键期早期（P25）,中期（P35）,末期（P45）以及成年后（P120）取材。取材前做F—VEP检测,黑箱饲养24h,曝光0．5h处理后经左心室主动脉灌注固定取材,切取各组大鼠脑组织视皮质17区,应用c—fos蛋白免疫组化染色分别比较单眼斜视弱视大鼠与正常大鼠视皮质光刺激诱导c—fos蛋白表达的阳性神经元的差异。结果各年龄组斜视组大鼠斜视眼N1P1、P1N2振幅与未剥夺眼相比大幅下降（P〈0．05）;视觉发育可塑性关键期早期和中期单眼斜视弱视大鼠与正常大鼠视皮质内光刺激诱导c—fos蛋白表达的阳性神经元差异无显著性（P〉0．05）;视觉发育可塑性关键期末和成年后单眼斜视弱视大鼠较正常大鼠视皮质光刺激诱导c—fos蛋白表达的阳性神经元多（P〈0．05）。结论c—los蛋白在成年弱视大鼠视皮质内神经元的表达增加,提示已过视觉发育敏感期成年弱视大鼠的视皮质神经元仍存留一定程度的视觉可塑性。     

大鼠视皮层两类神经元的NMDA及GABAA受体介导的突触后电流电学特性研究

目的 在视觉发育可塑性关键期内,探讨大鼠视皮层神经元的细胞类型与兴奋性和抑制性突触后反应的关系.方法 对出生后14～28 d龄正常大鼠进行视皮层脑片膜片钳全细胞记录,分别采用神经药理学方法分离和记录谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体介导的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)以及γ-氨基丁酸(galnma-aminobutyric acid,GABAA)受体介导的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents,IPSCs),并进行神经元细胞内标记、免疫细胞化学染色.结果 锥体细胞和颗粒细胞的NMDA受体介导的EPSCs峰值、上升时间、下降时间及NMDA/谷氨酸电流比率并无显著性差异(P＞0.05);锥体细胞GABAA受体介导的IPSCs下降时间较颗粒细胞的短(P＜0.05),而峰值和上升时间并无显著性差异(P＞0.05).结论 在视觉发育可塑性关键期内,GABAA受体在大鼠视皮层不同神经元的突触传递中可能发挥不同的作用,而NMDA受体在不同神经元的突触传递中具有同质性.     

正常和剥夺性弱视大鼠视皮质NOS阳性神经元的生后发育变化

目的：探讨NO参与正常视觉发育可塑性的分子机制及视觉剥夺对NO的表达所产生的影响。方法：正常和剥夺性弱视大鼠分别在不同时限(P14～P45)测定视皮质17区的NOS阳性神经元组织切片下的表达。结果 用光镜下计数和计算机图形分析系统得出。结果：正常大鼠视皮质17区中的NOS阳性神经元，P14时数量最多，到P21时神经元胞体截面积最大，树突分枝最复杂。剥夺对侧与同期正常鼠及剥夺同侧比较无显著性差异。结论：在视觉发育关键期，NOS在正常发育大鼠及剥夺性弱视大鼠视觉中枢中成短暂的高水平表达。单跟剥夺不会影响NOS在皮质17区的表达。     

大鼠视皮层硫化软骨素粘多糖降解对闪光诱发电位的影响

目的在视觉发育可塑性关键期终止前后,观察软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)降解LongEvans大鼠视皮层硫化软骨素粘多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)后闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,F-VEP)的变化。方法对出生后21、35、49d正常组及同时间点ChABC酶视皮层灌注组大鼠进行F-VEP检查。结果正常组大鼠21、35、49d,F-VEP主波的潜时逐渐缩短,分别为[(63.5±10.1),(50.8±6.4),(44.9±6.3)ms,P0.05],波峰值由21d的(15.7±3.8)ms增加至35d的(26.6±4.0)ms(P0.05),49d较35d稍降低。35、49dChABC酶视皮层灌注组大鼠F-VEP主波的潜时分别为(62.5±8.0),(58.4±7.6)ms,较同时间点正常组明显延长(P0.05),主波振幅两组间各时间点无明显差异(P0.05)。结论在视觉发育可塑性关键期终止前后,降解大鼠视皮层CSPGs影响了F-VEP的发育变化。     

大鼠视皮层神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体电流的发育变化

目的　探讨大鼠视觉发育可塑性关键期内视皮层神经元N 甲基 D 天冬氨酸 (NMDA)受体介导的突触后电流的发育变化。方法　采用脑片膜片钳全细胞记录技术 ,记录出生后 14、2 1、2 8d龄Wistar大鼠视皮层神经元兴奋性突触后电流。然后在人工脑脊液中加入荷包牡丹碱 ( 2 0 μmol/L) ,记录谷氨酸受体电流 ;接着在人工脑脊液中同时加入荷包牡丹碱 ( 2 0 μmol/L)和 6 氰基 7 硝基喹啉 2 ,3 二酮 ( 2 0 μmol/L) ,记录NMDA受体电流 ,并计算NMDA受体和谷氨酸受体的峰电流的比率。结果　大鼠睁眼后 ,视皮层神经元的NMDA受体电流的下降时间显著变短 (P <0 0 5 ) ,而上升时间无明显变化 (P >0 0 5 ) ;NMDA受体电流和谷氨酸受体电流比率逐渐变小 (P <0 0 5 )。结论　随着视觉输入的增加 ,大鼠视皮层神经元的NMDA受体电流的时程变短 ,其电流成分在谷氨酸受体电流中所占的比例相对减少     

体外原代培养胎鼠大脑皮层神经元NMDAR1亚基表达的发育性变化

目的 探讨体外原代培养胎鼠大脑皮层神经元NMDAR1（NR1）亚基表达的发育性变化。 方法 利用体外原代培养Wistar孕14～15d胎鼠大脑皮层神经元,采用免疫荧光法鉴定神经元的纯度和NR1亚基在神经元上的定位,采用流式细胞术和免疫印迹法（Western  blot）检测不同培养时间神经元NR1亚基的表达情况 结果 体外原代培养的胎鼠大脑皮层神经元纯度均达到90%以上,免疫荧光标记显示NR1亚基主要分布在神经元胞膜及树突干膜上,流式细胞仪检测培养1、2、3、4、6、9、12d神经元NR1亚基平均荧光强度分别为4.57±0.99、8.18±1.22、13.67±1.99、20.33±1.03、26.30±2.88、31.71±2.47、28.63±1.40,Western blot显示细胞膜蛋白中NR1亚基在1～2d表达微弱,3～6d表达逐渐增高,6d以后保持稳定。  结论 体外原代培养的胎鼠大脑皮层神经元NR1亚基有发育性变化,这种变化与神经元的成熟度有关。     

惊厥和亚惊厥剂量戊四唑对大鼠脑内NMDA受体亚单位蛋白表达的影响

目的:研究不同剂量戊四唑刺激对大脑皮层内N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体NR1、NR2A和NR2B 3种亚单位表达量的影响.方法:腹腔注射亚惊厥剂量(35 mg/kg)和惊厥剂量(50 mg/kg)的戊四唑,注射后不同时间点分离大脑皮层,用免疫印迹法检测NMDA受体NR1、NR2A、NR2B 3种亚单位的蛋白含量.结果:注射戊四唑亚惊厥剂量和惊厥剂量组大鼠的行为学差异非常显著(P＜0.001),但NMDA受体3种亚单位仅NR2A亚单位在1 h点有显著性增高,且惊厥剂量组NR2A的表达量比亚惊厥剂量组高(P＜0.05).惊厥剂量组NR2A和NR2B表达有先增加再降低然后恢复至正常水平的趋势,而NR1亚单位改变不明显.结论:戊四唑引起惊厥的机制可能与戊四唑首先影响NR2亚单位蛋白的表达,以调节NMDA受体的功能有关.     

三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1表达的作用

目的:研究三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1的作用。方法:用免疫组化法观察胶原酶诱导的脑出血大鼠前脑内NR1在给药组和对照组的表达变化。结果:脑出血后大鼠前脑NR1在病灶内部少量表达,病灶周围、大脑皮质、海马等部位均有不同程度的高表达,给药组在皮层、病灶周围阳性细胞明显减少,反应强度减弱。结论:三七总皂苷明显降低NR1在病灶周围、皮层海马神经元的阳性表达,从而发挥对受损神经元的保护作用。     

缺氧对大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响

目的 观察缺氧模型大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位酪氨酸磷酸化的变化.方法 成年大鼠置于模拟海拔5 500 m高度的低压氧舱内,每天缺氧8 h,分别缺氧3、7、14 d和21 d.采用免疫组化、Western blot 免疫共沉淀方法检测皮层、海马NR1及其酪氨酸磷酸化的变化.结果 免疫组化显示缺氧皮层、海马NR1表达都明显高于对照组(P《0.01).Western blot检测进一步证明NR1的表达显著高于对照组(P《0.01),且随着缺氧时间的延长而增加.缺氧各组酪氨酸磷酸化水平亦显著高于对照组(P《0.01),缺氧14 d后酪氨酸磷酸化达到最高峰,而后开始下降,21 d时仍显著高于对照组(P《0.01).结论 高原缺氧条件下大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位表达及酪氨酸磷酸化水平显著增加,酪氨酸磷酸化的变化可能是影响NMDA受体功能的主要原因.     

早期惊厥样放电对发育中神经元NMDA受体1表达的远期影响

目的探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体1（N—methyl—D—aspartate receptor1，NR1）表达的远期影响。材料与方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型。根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组：正常DMEM培养液组（GONT1）、正常细胞外液组（CONT2）和无镁细胞外液组（MGF）。神经元分别在上述三种液体中孵育3h，然后恢复正常DMEM培养基继续培养，分别应用实时定量PCR与Westernblot方法在培养7、12及17d时测定皮层神经元NMDA受体1mRNA与蛋白表达的变化。结果在正常DMEM培养液中，NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d时处于较高水平，以后逐渐下降，以培养12d为最低。与GONT2和GONT1组相比，MGF组NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d皮层神经元均明显降低，在12d时明显增高（P〈0．05）。GONT2组与GONT1组相比无统计学差异（P〉0．05）。结论发育中皮层神经元早期无镁诱导惊厥样放电对NMDA受体1mRNA与蛋白表达具有远期影响，提供了神经元早期惊厥样放电引起远期功能损伤的可能机制。     

μ型阿片肽受体对癫痫敏感大鼠海马NR2B表达的影响

目的探讨μ型阿片肽受体（MORs）介导大鼠癫痫敏感性形成过程中海马NMDA2B受体（NR2B）表达变化。方法红藻氨酸（KA）皮下注射建立大鼠癫痫发作模型,采用脑立体定位及微渗透泵技术,海马内微量注射MORs激动剂PL017,或和拮抗剂β-FNA。7d后通过阈下剂量KA检测大鼠癫痫发作敏感性,应用原位杂交方法观察海马CA1区锥体细胞及齿状回颗粒细胞NR2B表达变化。结果PL017可显著增加大鼠海马CA1区锥体细胞和齿状回颗粒细胞NR2BmRNA（＋）神经元数及平均灰度。β-FNA则明显降低两个脑区的NR2BmRNA（＋）神经元数及平均灰度。结论MORs介导癫痫发作敏感性形成机制与NR2B表达上调有关。     

补阳还五汤对全脑缺血再灌大鼠皮层神经元NR1的影响

目的：研究补阳还五汤抗全脑缺血后再灌注损伤的分子机制。方法：将66只SD大鼠随机分为3组,即正常组、模型组和药物组（补阳还五汤顸干预）,模型组和药物组再分别设置2、24h2个观察时间点。连续给药5d后．采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法复制全脑缺血大鼠模型,再灌后2、24h采用免疫组化法检测各组大鼠皮质神经细胞NMDA受体（N—methyl—D—aspartic acid receptor）亚单位NR1的表达水平。结果：与正常组比较,模型组2、24h2个不同时间点,NR1的表达水平显著升高（P〈0．05）;与模型组比较,药物组再灌注后2、24h2个不同时间点,NR1表达水平显著降低（P〈0．01）。结论：补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注模型大鼠大脑皮层神经元NR1表达水平的增高有调低作用。     

Humanin抑制NR1亚基表达和NR2B亚基磷酸化的神经保护作用

目的：探讨Humanin （HN）通过抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化在兴奋性神经毒中发挥的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法：利用原代培养的Wistar大鼠皮层神经元建立NMDA诱导的兴奋性神经毒模型,将神经元分为对照组、NMDA组、NMDA+MK-801（MK-801）组和NMDA+HN（HN）
组。流式细胞术荧光定量检测各组神经元膜NMDA受体NR1亚基蛋白的表达,Western blotting法检测各组神经元膜NMDA受体NR2B亚基Tyr1472位点的磷酸化水平。结果： 倒置相差显微镜观察,NMDA组中的神经元胞体肿胀,个别细胞变成圆形,胞体周围光晕模糊,神经元突起大部分消失,表现出明显的神经毒性作用。流式细胞术免疫荧光定量检测,与对照组比较,NMDA组NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显增加（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组的NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,各组神经元的NR2B亚基总蛋白的表达水平无改变;与对照组比较,NMDA组NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平明显升高（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组均能降低NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平（P<0.05）。 结论： NMDA受体NR1亚基蛋白表达水平的增加和NR2亚基磷酸化可能参与NMDA诱导的兴奋性神经毒作用;HN可能通过抑制NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化而发挥对神经元的保护作用。