人巨细胞病毒对造血系统的影响

目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)对造血系统的影响及其机制。方法 采用造血祖细胞体外半固体培养技术,研究HCMV AD169株对粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU—E)、多向造血祖细胞(CFU—Mix)及巨核系祖细胞(CFU-MK)集落生长的影响;分别用原位聚合酶链反应(IS-PCR)和聚合酶链反应(PCR)检测CFU-GM、CFU-Mix、CFU-MK及CFU-E集落细胞中的HCMV DNA;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CFU-E集落细胞中的晚期抗原(late antigen,LA)mRNA及CFU-MK集落细胞中的前早期抗原(immediate early antigen,IEA))mRNA;用免疫组化方法检测CFU—Mix集落细胞中HCMV早期蛋白P52。结果 HCMV AD169株在体外能明显抑制CFU—GM、CFU—E,CFU—Mix及CFU—MK的生长,抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系;经IS-PCR或PCR检测发现病毒感染组CFU-GM,CFU-E,CFU-Mix及CFU-MK细胞中有HCMV DNA存在;RT—PCR检测发现病毒感染组CFU-MK细胞中有IEA mRNA的表达,而CFU-E细胞中的LA mRNA为阴性;免疫组化(IHC)检测发现病毒感染组CFU-Mix集落细胞中有HCMV P52的表达。结论 HCMV AD169可抑制CFU-GM,CFU-E,CFU-Mix及CFU-MK的分化和增殖;HCMV AD169对造血系统有直接损害作用。此作用可能是HCMV感染所致的粒细胞和血小板减少及贫血的原因之一。     

人巨细胞病毒感染对脐血巨核系祖细胞体外增殖的影响

目的　探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对脐血巨核系祖细胞 (CFU Mk)体外增殖的影响及其机制。方法　采用造血祖细胞体外培养技术 ,观察、计数HCMV AD169感染的CFU Mk集落产率、抑制率、集落峰值及维持时间 ;并采用聚合酶链反应 (PCR)技术检测集落细胞内HCMV AD169DNA。结果　 1.HCMV AD169感染组集落产率较对照组明显减少 ,HCMV对CFU Mk集落的抑制程度与病毒滴度有关 ,集落产率随病毒感染滴度增高而减少 ,抑制率随病毒感染滴度增高而渐增加 ;各组集落峰值出现时间无明显差异 (P均 >0 .0 5 ) ,但各感染组集落维持时间明显短于对照组 (P <0 .0 1) ;2 .用PCR在集落细胞内检测到HCMV AD169DNA。结论　CFU Mk是HCMV的宿主细胞之一 ,HCMV能直接感染CFU Mk ;在体外HCMV AD169对CFU Mk的增殖和集落形成有明显抑制作用 ,此作用可能与临床HCMV感染后患者血小板减少有关     

巨细胞病毒感染对淋巴系祖细胞增殖的影响及其干预措施

目的探讨人类巨细胞病毒（HCMV）对淋巴系祖细胞（CFU-TL）体外增殖的影响、作用机制及其干预措施。方法本实验共分为空白对照组、灭活对照组、HCMV感染组、更昔洛韦（GCV）干预组、黄芪注射液（AMI）干预组5组。采用甲基纤维素半固体培养CFU-TL集落，不同浓度HCMV-AD169持续攻击CFU-TL，用AMI、GCV粉剂干预，观察CFU-TL集落形成：用四甲基偶氮唑盐法测HCMV对宿主细胞增殖活性的影响；用PCR检测CFU-TL集落细胞内HCMV-AD169DNA。结果1．与空白对照组及灭活对照组比较，各病毒感染组CFU-TL集落产率明显减少、维持时间明显缩短（P均〈0．01），抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系；2．HCMV感染48、72、96、120h对宿主细胞增殖活性的影响与对照组比较均有显著差异（F分别为11．412，18．058，13．259，56．360 P均〈0．01）。3．PCR检测到HCMV感染组CFU-TL集落细胞内HCMV-AD169DNA。4．与HCMV感染组比较，HCMV＋AMI组、HCMV＋GCV组CFU-TL集落产生率明显增加，集落维持时间均显著延长（P均〈0．01）。结论HCMV在体外能抑制CFU-TL集落的增殖和分化；HCMV感染患儿免疫功能低下可能与HCMV直接抑制CFU-TL有关；GCV、AMI在体外能有效干预HCMV感染所致的CFU-TL增殖抑制的发生。     

黄芪注射液对人巨细胞病毒感染的粒-单系祖细胞体外增殖的影响

目的：探讨黄芪注射液对人巨细胞病毒(HCMV)感染的粒—单系祖细胞(CFU-GM)体外增殖的影响。方法：采用造血祖细胞体外培养技术,用黄芪干预HCMV感染的CFU-GM,观察计数CFU-GM的产率,大小,峰期及维持时间。结果：①黄芪组每2×105个细胞中CFU-GM簇和集落的产率分别为 333.33±12.69 和81.23±4.93,病毒组每2×105个细胞中簇和集落的产率分别为 167.80±16.63,53.70±1.67,两者相比差异有显著性(P<0.01)。②黄芪组大集落的比例占(9.5±0.8)%,明显高于病毒组(2.7±1.0)%,P<0.01。③黄芪组大集落峰期出现早,集落和大集落维持时间长。结论：在体外黄芪注射液可以促进HCMV感染的CFU-GM增殖。     

人巨细胞病毒抑制粒-单及红系祖细胞的体外增殖及干预研究

探讨人巨细胞病毒 (HCMV)抑制脐血粒 -单系祖细胞的 (CFU GM)、红系爆式祖细胞 (BFU E)及红系祖细胞 (CFU E)的体外增殖和黄芪注射液与更昔洛韦(GCV)对此的干预作用 ,采用造血祖细胞体外培养、聚合酶链反应 (PCR)技术 ,培养、观察、计数CFU GM、BFU E及CFU E集落产率、抑制率、提高率 ,集落峰值时间和集落维持时间 ,并用PCR检测集落细胞内HCMV DNA。结果显示 :①HCMVAD169对CFU GM、BFU E及CFU E均有抑制作用 ,其抑制作用与HCMV浓度有关 ,高浓度 ( 1∶1 0 ,1 1 0 0 )感染组与对照组比较集落产率明显下降 (P <0 0 1 ) ,集落维持的时间明显缩短 (P <0 0 1 ) ,集落峰值时间无明显差异 (P >0 0 5) ,而低浓度组 ( 1∶1 0 0 0 )无此作用 ;②PCR检测发现在HCMV感染的造血祖细胞内存在HCMV DNA ;③在 1∶1 0感染组中 ,加入黄芪注射液与更昔洛韦后 ,HCMVAD169感染的CFU GM、BFU E及CFU E集落产率明显增加 (P <0 0 1 )。结论 :①造血祖细胞是HCMVAD169的宿主细胞之一 ,HCMVAD169能直接感染造血祖细胞 ;②在体外HCMVAD169对CFU GM、BFU E、CFU E的生长 ,集落形成有明显的抑制作用 ;③黄芪与更昔洛韦有抗HCMV作用 ,能促进受HCMV感染的造血祖细胞集落增殖     

脐血造血干祖细胞增殖过程中人类巨细胞病毒感染对hoxa9、hoxa10基因表达影响的研究

目的在基因水平探讨人类巨细胞病毒(HCMV)感染导致脐血CFU-G损伤的机制,探讨人类脐血造血干细胞(HSC)向粒系祖细胞(CFU-G)增殖过程中hoxa9、hoxa10基因表达的情况。方法从2006年5月至2007年10月收集12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,以HCMV-AD169和(或)全反式维甲酸(ATRA)持续干扰HSC,观察正常对照组、ATRA组、HCMV-AD169组、ATRA+HCMV组的造血干祖细胞经人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导后,在增殖分化过程中第3、7和12天检测CFU-Ghoxa9、hoxa10基因表达情况。结果各组hoxa9、hoxa10基因均在CFU-G增殖分化的第7天表达量最高(P0.01),第12天表达量明显减弱(P0.01),与正常对照组比较,CFU-Ghoxa9、hoxa10基因表达受ATRA(6×10-8mol/L)上调,而受HCMV下调(P0.01),与HCMV组比较,ATRA可上调HCMV感染的CFU-Ghoxa9、hoxa10基因的表达。结论 CFU-G的增殖分化与hoxa9、hoxa10基因的表达相关。HCMV可能通过调控hoxa9、hoxa10基因表达异常引起造血功能异常,ATRA不仅能显著上调正常CFU-Ghoxa9、hoxa10基因的表达,而且能上调HCMV感染的CFU-Ghoxa9、hoxa10基因的表达。     

巨细胞病毒抑制多向祖细胞的增殖及干预研究

目的　在体外已证实人巨细胞病毒 (HCMV)能抑制骨髓造血祖细胞的增殖。该研究观察HCMV对脐血多向造血祖细胞 (CFU Mix)体外增殖的影响及黄芪和更昔洛韦 (GCV)对此的干预作用。方法　采用造血祖细胞体外培养技术 ,观察HCMV AD1 69感染的CFU Mix集落数、抑制率、提高率、集落峰值及集落维持时间 ;用聚合酶链反应 (PCR)技术检测集落细胞内HCMV AD1 69DNA。在 1∶1 0HCMV感染组中分别加入黄芪和 /或GCV ,观察黄芪和GCV干预HCMV AD1 69对CFU Mix增殖的抑制作用。结果　① 1∶1 0 ,1∶1 0 0 ,1∶1 0 0 0三种滴度HCMV AD1 69感染的CFU Mix集落数较对照组明显减少 (P <0 .0 5 ) ,集落数随病毒感染滴度的增高而减少 ,抑制率随病毒感染滴度的增高而逐渐增加 ;②各组集落峰值出现时间无明显差异 (P >0 .0 5 ) ,但感染组集落维持时间明显短于对照组 (P <0 .0 1 ) ;③ 1∶1 0 ,1∶1 0 0 ,1∶1 0 0 0病毒感染组中检测到HCMV AD1 69DNA ;④ 1∶1 0感染组中加入黄芪和 /或GCV后 ,HCMV AD1 69感染的CFU Mix集落数明显高于未加药 1∶1 0感染组 (P <0 .0 5 )。结论　CFU Mix是HCMV的宿主细胞之一 ,HCMV能直接感染造血祖细胞 ;在体外HCMV AD1 69对CFU Mix生长和集落形成有明显抑制作用 ;黄芪和GCV有明显的抗HCMV作用 ,二者联     

人巨细胞病毒对多向造血祖细胞的影响

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）对多向造血祖细胞（CFU－Mix)的抑制作用及其机制。方法：采用造血祖 外半固体培养技术,研究HCVMVAD169株对脐血CFU－Mix集落生长的影响;用原位聚合酶链反应（IS－PCR）检测集落细胞中的HCVM DNA;用免疫组化方法检测集落细胞中HCV早期蛋白P52。结果：HCMVAD169在体外能明显抑制UF－Mix集落生长,集落数随病毒感染滴度的增高而减少,抑制幅度亦加大的趋势;经IS－PCR检测发现病毒感染线CFU－Mix集落细胞中有HCVMVDNA存在,免疫组化检测发现病毒感染缄CFU－Mix涨集落细胞中有HCMV P52的表棕,结论HCMV AD169可抑制 CFU－Mix的分化、增殖;HCMV AD169对CFU－Mix有直接损害作用。此作用可能 是HCMV感染所致的粒细胞和血小板减少,贫血的主要原因;并证实CFU－Mix集落细胞右存在HCMV蛋白的早期表达。     

经人类巨细胞病毒感染的人脐血造血干细胞向淋巴系造血祖细胞增殖分化过程中同源盒b4、b6基因的表达

目的 探讨经人类巨细胞病毒(HCMV)感染的人脐血造血干细胞(HSC)向淋巴系造血祖细胞(CFU-TL)增殖分化过程中同源盒(hox)b4、b6基因的表达.方法 取健康母亲健康足月顺产儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血祖细胞体外培养技术,分组以HCMV-AD169病毒液和(或)全反式维A酸(ATRA)持续干预,观察其不同时间点各组细胞集落生成情况,并在鉴定为CFU-TL集落细胞后不同时间点分别提取各组细胞核精核酸(RNA)并检测其完整性;将提取到的总RNA反转录为互补脱氧核糖核酸,在不同时间点采用实时荧光定量反转录PCR(FQ-RT-PCR)技术检测各组hoxb4、hoxb6基因的表达.结果 1.培养的集落细胞经瑞-姬染色法染色,鉴定为CFU-TL.2.各组所提取的RNA结构基本完整.3.人脐血HSC向CFU-TL增殖分化过程中(体外),各组hoxb4、hoxb6基因均有表达.且随培养时间推移,hoxb4基因表达的相对水平逐渐降低;而hoxb6基因表达的相对水平在培养第7天最高,第12天降低.4.与空白对照组比较,ATRA组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平显著增高,而HCMV组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平较低.5.与HCMV组比较,HCMV加ATRA组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平较高.结论 1.hoxb4、hoxb6基因在人脐血HSC向CFU-TL增殖分化过程中(体外)均有表达,提示其均与淋巴系统造血密切相关.2.HCMV能下调CFU-TL hoxb4、hoxb6基因的表达(体外),提爪HCMV可能通过调控hoxb4、hoxb6基因表达异常导致造血功能异常.3.ATRA能显著上调正常CFU-TLhoxb4、hoxb6基因的表达.实用儿科临床杂志,2009,24(10):757-759     

人巨细胞病毒对人脐血红系祖细胞生长的影响及作用机制研究

人巨细胞病毒 (humancytomegalov irus ,HCMV)感染在我国发生率达 80 %～ 90 % [1 ] ,大多数是潜伏感染。造血系统是其感染的主要受累部位之一 ,引起各系血细胞减少 ,其机制尚未明了 ,本文旨在探讨HCMV对人脐血红系祖细胞生长的抑制和其作用机制。　　脐血标本 :2 0例脐血标本由本院产房提供 ,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。其母亲健康 ,HBsAg阴性 ,每份标本常规ELISA检测抗CMV IgG ,PCR检测HCMVDNA均为阴性 (共筛查 2 5例标本获得 )。病毒 :HCMV毒株为HCM VAD169,购自同济医科大学同济医院 ,感染滴度为 10 …     

Cryopreservation of Pluripotent and Committed Hemopoietic Progenitor Cells from Human Bone Marrow and Cord Blood

As one of the studies on autologous bone marrow transplantation for childhood cancer, the viabilities of several kinds of hemopoietic progenitor cells after cryopreservation was assayed using bone marrow and cord blood samples. The mean recovery rates of granulocyte-macrophage colony forming units (CFU-GM), erythroid burst forming units (BFU-E) and erythroid colony forming units (CFU-E) from bone marrow cells were 47.9%, 31.3% and 10.5%, respectively. The mean recovery rates of CFU-GM, BFU-E and CFU-E from cord blood cells were 46.7%, 39.1% and 22.4%, respectively. The ratio of primitive to mature BFU-E did not change after cryopreservation. The mean recovery rate of mixed colony forming units (CFU-mix) from marrow cells was 30.2%, and that from cord blood cells was 58.9%, demonstrating their sufficient proliferative activity after cryopreservation. These results demonstrate that CFU-mix, primitive BFU-E as well as CFU-GM, mature BFU-E can be well cryopreserved, supporting the usefulness of autologous marrow transplantation for the rescue of the ruined hemopoiesis after intensive cancer therapy.     

再生障碍性贫血患儿骨髓祖细胞培养的临床意义

目的探讨再生障碍性贫血(AA)患儿红细胞集落生成单位(CFU-E)、爆式红细胞集落生成单位(BFU-E)、粒细胞-单核细胞集落生成单位(CFU-GM)及巨核细胞集落生成单位(CFU-Meg)骨髓祖细胞培养情况,了解骨髓祖细胞在AA发病中的作用及意义。方法抽取28例AA患儿骨髓3～4mL,以淋巴细胞分离液提取单个核细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,调节单个核细胞水平为106/mL,取0.3mL分别接种于红系、粒-单核系、巨核系培养基分别作4类祖细胞培养,在7、14d测定其集落数。结果28例AA中,4类集落数均值与对照组比较,差异有显著意义(P<0.01或P<0.001)。集落数随病情加重而逐步下降。4类集落数低于对照组患儿下限所占百分比分别为BFU-E35.71%、CFU-E85.71%、CFU-GM75.00%、CFU-Meg89.29%。治愈及进步者4类集落数接近对照组水平,治疗无效及进展者与治疗前比较无变化。结论动态监测AA患儿骨髓4类祖细胞集落数变化对辅助诊断、观察疗效及预后判断均有指导意义。     

造血干细胞分化过程中HOXB6基因表达及干预研究

目的探讨脐血造血干细胞(HSC)向粒-单系(CFU-GM)、红系(CFU-E)和淋巴系祖细胞(CFU-TL)增殖分化过程中HOXB6基因的表达情况及全反式维A酸(ATRA)对其的影响。方法1.采用造血干/祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类脐血造血干/祖细胞,观察HSC经人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和植物血凝素(PHA)分别诱导后,在培养第3天、第7天和第12天的CFU-GM、CFU-E及CFU-TL集落生成情况。2.采用实时荧光定量RT-PCR技术(FQ-RT-PCR)检测造血干细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平。结果1.人类造血干细胞向CFU-GM、CFU-E和CFU-TL增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均有表达。2.随时间推移,CFU-GMHOXB6 mRNA在增殖分化的第3天开始表达,第7天表达最强烈,第12天表达明显减弱;CFU-E HOXB6 mRNA表达在第3天、第7天和第12天均持续增强;而在CFU-TL中,HOXB6 mRNA表达在第7天最强烈,第12天表达减弱。3.与对照组比较,ATRA可上调各组HOXB6基因的表达。结论1....     

人脐血间充质干细胞对脐血CD+34细胞体外扩增作用的研究

目的 探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法 (1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD34^ 细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记：CD34^ 、CD34^ CD38^-、CD34^ CD3^ 、CD34^ CD19^ 、CD34^ 和CD34^ CD41^ 。细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、混合集落形成单位(CFU-Mix)及高增殖集落形成单位(CFU-HPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD34^ CD38^ 细胞的扩增倍数在第6天和第12大分别为159和437倍。该业群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1．98％,而在含脐血MSCs组为9．98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFU-Mix和CFU-HPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD34^ CD3^ 和CD34^ CD41a^ 细胞均明显增加,而CD34^ CD19^ 和CD34^ CD3^ 细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论 (1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干／祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD34^ 细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。     

Effects of recombinant thrombopoietin on the growth of murine primitive and committed hematopoietic progenitors in serum-free culture

BACKGROUND: The aim of the present study was to determine the effect of thrombopoietin (Tpo) in combination with other cytokines on the growth of murine megakaryocytic, granulocyte-macrophage, erythroid and primitive hematopoietic progenitor cells, excluding possibilities of synergistic effects by serum factor(s). METHODS: Serum-free clonogenic assay systems were used for assay of colony forming units in megakaryocytes (CFU-Mk), colony forming units in granulocytes-macrophages (CFU-GM), burst-forming units in erythrocytes (BFU-E) in marrow of normal mice and of high proliferative potential colony forming cells in 5-fluorouracil-treated marrow. RESULTS: Serum-free culture enabled megakaryocyte colony growth by recombinant murine (rm) Tpo and this was synergistically supported with rm interleukin (IL)-3, rm stem cell factor (SCF) or recombinant human (rh) erythropoietin (Epo). Recombinant human IL-6, rhIL-11 and rm granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) showed synergistic effects with rmTpo only in the presence of serum. Recombinant murine IL-3 or rmSCF increased the large colonies and mixed-type colonies containing other populations, suggesting that these cytokines promoted the proliferation of immature populations of CFU-Mk. The rmTpo enhanced the growth of granulocyte-macrophage (GM) colonies stimulated by rmGM-CSF or rmIL-3 and erythroid bursts by rhEpo, with or without rmIL-3. The rmTpo also significantly increased HPP colonies in synergy with rmIL-3 only in the presence of serum or rmSCF. CONCLUSION: Serum-free culture is valuable for evaluating synergistic effects of cytokines and Tpo acts not only on megakaryocytic progenitors but also on granulocyte-macrophage, erythroid and primitive progenitor cells in combination with other cytokines, such as rmIL-3 and rmSCF. However, serum or SCF was required for enhancement of the colony growth of primitive progenitors by Tpo.     

In vitro CFU-E and BFU-E responses to androgen in bone marrow from children with primary hypoproliferative anaemia: a possible therapeutic assay

The effects of natural and synthetic androgens on erythroid colony formation in children's bone marrow cultures were studied using a methylcellulose microculture assay. In an attempt to predict the clinical response to androgens in two children with Fanconi anaemia (FA) and two children with Diamond-Blackfan syndrome (DB), we tested the hormonal stimulation of testosterone, nortestosterone and etiocholanolone on CFU-E, BFU-E and uroporphyrinogen I synthase activity (UROS). We observed that colony formation and UROS activity were reduced when compared to values obtained with normal children's bone marrow cultures. The addition of steroids to the cultures significantly enhanced the numbers of CFU-E and BFU-E derived colonies and their UROS activity in marrow from patients with FA and one patient with DB. The strong depletion of marrow progenitor cells in the unresponsive marrow from child 4 with DB could explain the absence of hormonal response. Whereas the responsiveness to steroids varied according to the individual, the in vitro testing of erythroid differentiation in the presence of androgens theoretically may lead to an effective prediction of response to therapy in children with hypoplastic anaemia.Abbreviations FA Fanconi anaemia - DB Diamond-Blackfan syndrome - BFU-E burst forming unit-erythroid - CFU-E colony forming unit-erythroid - UROS uroporphyrinogen I synthase - EPO erythropoietin