血管内皮生长因子对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨缺氧对培养人静脉内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预性影响。方法 （1）人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定。（2）建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型,TUNEL法观测不同缺氧时间（0、12、24、48h）对内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预作用。结果 随缺氧时间延长,NUVECs凋亡率显著升高,血管内皮生长因子抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡。结论 内皮细胞的过渡凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素,血管内皮生长因子通过抑制内皮细胞凋亡,而具有内皮细胞保护作用。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较

目的：研究干细胞定向分化为内皮细胞的效率,并与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)比较。方法：用两步法诱导干细胞HUES9分化为内皮细胞,前3 d在N2B27培养基中加入骨形态发生蛋白4 (25 ng/mL)和肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021(10 μmol/L)使细胞分化到中胚层状态,第4天开始用 VEGF165(200 ng/mL)和Forskolin(2 μmol/L)将细胞诱导为内皮细胞。观察分化第6天细胞形态,并与HUVECs比较。用 CD144作为内皮细胞表面标志物,流式细胞术检测分化效率及分化后细胞的身份。比较两种内皮细胞迁移和成管能 力。结果：分化后的内皮细胞与HUVECs在显微镜下形态一致。分化细胞表面标志物阳性率达到73.4%,重新培养后 的内皮细胞表面CD144阳性率达到86.6%,HUVECs为94.4%。分化后的内皮细胞与HUVECs均具有良好的迁移和成管 能力,但分化后的内皮细胞能力不如HUVECs强。运用SB431542后,能够提高分化后内皮细胞的迁移和成管能力。 结论：此两步法将干细胞分化为内皮细胞有较高的分化效率,可作为理想的分化方法。     

Effect of Cytokines Secreted by Human Adipose Stromal Cells on Endothelial Cells

Recently, several observations have pointed to the presence of a population named adipose-derived adult stem cells (ADAS) or adipose stromal cells (ASCs) in human adipose tissue. Subsequent studies revealed that ASCs were multipotent, differentiating along the cardiac myocyte, endothelial, neuronal, and other cells lineages[1, 2], and could secrete cytokines such as HGF and VEGF[3]. Since adipose tissue is an abundant, accessible, and re- plenishable source of adult stem cells that can b…     

缺氧环境下A549细胞促进人脐静脉内皮细胞迁移及血管形成

目的 研究在缺氧条件下A549 细胞对人脐静脉内皮细胞（ HUVEC） 迁移及微血管形成的影响。方法 A549 细胞在常氧组（ 21% O2 ） 、缺氧组（ 2% O2 ） 、无氧组（ 0% O2 ） 中培养24 h 后, 通过倒置相差显微镜观察细胞形态、MTT 法检测细胞增殖、免疫细胞化学技术检测细胞内低氧诱导因子1α（ HIF-1α） 蛋白量以确定缺氧模型建立是否成功。随后取常氧组、缺氧组的A549 细胞上清液、HUVEC 细胞培养液干预HUVEC, 用细胞划痕实验、微丝绿色荧光染色方法观察各组HUVEC 的迁移情况及伪足形成, 体外HUVEC 三维培养技术观察血管形成情况。结果 与常氧组比较, 缺氧组A549细胞的生长状态好, 增殖明显; 无氧组A549 细胞生长状态差, 细胞数量减少; 缺氧组及无氧组A549细胞均有HIF-1α表达, 且缺氧组表达更加明显。与细胞培养液干预组比较, 缺氧上清液干预组和常氧上清液干预组A549 细胞的HUVEC 均有不同程度的迁移、伪足结构形成及血管管腔样结构形成,且前者较后者明显。结论 缺氧环境下A549 细胞生长状态良好, 增殖明显, 而无氧环境下则不利于A549 细胞的生长。缺氧环境下A549 细胞能促进HUVEC 的迁移、伪足形成及血管形成。     

肝细胞生长因子促血管内皮细胞增殖及迁移的研究

目的:探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响及其促血管生成作用.方法:从脐静脉体外分离培养HUVEC,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察rhHGF对HUVEC的增殖作用,倒置显微镜观察HUVEC的迁移,透射电镜观察超微结构的改变及流式细胞仪检测细胞周期的改变.结果:(1)rhHGF对培养的HU-VEC有显著的促增殖和迁移作用,且成浓度和时间依赖性.(2)rhHGF促使HUVEC细胞超微结构的改变,线粒体和粗面内质网增多,常染色质增多(3)细胞周期分布改变:S期、G2/M期细胞增多.结论:rhHGF能显著促进HUVEC的增殖和迁移,提示其可能具有促血管生成作用.     

可注射型富血小板纤维蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管能力的体外实验研究

目的 探究可注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成血管分化能力的影响。方法 CCK-8实验检测HUVECs增殖能力并筛选最佳浓度的可注射型富血小板纤维蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe);划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs迁移能力和成血管分化能力;实时定量PCR检测成血管相关基因的mRNA表达。结果 0.4 mg/mL浓度的iPRFe促进HUVECs增殖效果最佳;iPRFe对HUVECs迁移和小管形成有显著的促进作用,还能明显提高血管生成素(angiogenin, ANG)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达水平。结论 iPRF可以促进HUVECs增殖、迁移和成血管能力,有望成为用于牙髓再生的新材料。     

雷帕霉素抑制人脐静脉内皮细胞增殖与迁移

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin)对脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移的抑制作用。方法应用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞仪、迁移实验研究不同浓度雷帕霉素对血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖、迁移的影响。结果雷帕霉素浓度大于10ng/ml、作用48h以上可以明显抑制VEGF诱导的HUVECs的增殖(P<0.05),呈时间、剂量依赖性;流式细胞仪检测细胞被阻滞在G0/G1期,并诱发了细胞凋亡;利用Transwell装置证实雷帕霉素浓度大于10ng/ml时抑制了HUVECs的迁移。结论雷帕霉素可通过抑制血管内皮细胞的增殖与迁移抑制血管生成。     

RhoA在缺氧诱导的乳腺癌细胞VEGF分泌和血管内皮细胞增殖、迁移及管腔形成中的作用

目的观察RhoA在缺氧诱导下对乳腺癌细胞MCF-7分泌VEGF水平的影响,以及对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖、迁移和管腔形成的作用。方法 ELISA检测缺氧条件下MCF-7细胞中RhoA的活化与失活对VEGF分泌水平的影响;建立MCF-7/HUVEC共培养模型,观察在缺氧刺激下MCF-7细胞中RhoA活性的变化对HUVEC增殖、迁移和管腔形成的影响。结果缺氧条件下,活性RhoA可以促进MCF-7细胞VEGF分泌,沉默RhoA可以抑制VEGF分泌;在共培养模型中,当MCF-7细胞中RhoA活化时,可以促进HUVEC增殖、迁移和管腔形成,而MCF-7细胞中RhoA沉默时,则HUVEC的上述生物学行为受到抑制。结论在缺氧刺激下,RhoA可能通过调控肿瘤细胞VEGF的表达水平,间接影响HUVEC的增殖、迁移和管腔形成能力,从而参与肿瘤新生血管的形成过程。     

TRPC_3参与缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡

目的:探讨瞬时受体电位通道蛋白3(TRPC3)在缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡中的作用。方法:采用HUVECs细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,实验组分为常氧对照组(5%CO2+95%空气)和缺氧组(1%O2+5%CO2+94%N2),处理24h后,应用实时荧光定量RT-PCR法及WesternBlot法检测TRPC3mRNA和蛋白水平的表达变化。构建靶向TRPC3基因的siRNA和无关序列质粒表达载体,分别转染至HUVECs,缺氧处理后再用四甲基偶氮唑盐比色法(Methods the tetrazolium,MTT)检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡。结果:缺氧处理24h,HUVECs中TRPC3mRNA和蛋白表达明显升高,细胞存活率为67.4%,与常氧对照组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3干扰组细胞存活率为92.7%,与缺氧组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3假干扰组与缺氧组无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下观察,常氧对照组胞核均匀蓝染;缺氧处理组和缺氧+TRPC3假干扰组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;而缺氧+TRPC3干扰组胞核均匀蓝染。结论:TRPC3参与缺氧诱导HUVECs凋亡。     

基质细胞衍生因子-1对人脐静脉血管内皮细胞迁移的影响

目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移中的作用及其信号转导机制。方法:以HUVEC为实验材料,首先利用免疫荧光技术及蛋白印迹方法检测HUVEC表达SDF-1α受体CXCR4,其次利用Boyden chamber体外迁移体系,先观察不同浓度的SDF-1α对HUVEC迁移的影响,最后以磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)阻断剂wortmannin(50 M)或LY294002(10μM)、丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)阻断剂PD98059(50μM)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)阻断剂U73122(10μM)、CXCR4特异性阻断剂AMD3100(0.1 mg/ml)等不同预处理HUVEC 30 min,观察分析SDF-1α对HUVEC迁移影响的信号转导通路。结果:培养的HUVEC表达SDF-1α受体CXCR4,HUVEC体外迁移能力随着SDF-1α浓度的递增而逐渐增强,并且SDF-1α浓度在100 ng/ml时,HUVEC迁移到滤膜上的细胞数最多;Wort-mannin、LY294002、PD98059、U73122、AMD3100对HUVEC迁移均有影响,其中U73122、AMD3100对HUVEC迁移阻断的效应最显著。结论:SDF-1α/CXCR4所介导的HUVEC迁移与MAPK)、PI-PLC和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关,且PKC途径可能处于中心环节。     

Effects of stromal-derived factor 1 preconditioning on apoptosis of rat bone mesenchymal stem cells

The effects of stromal-derived factor 1 preconditioning （PC） on apoptosis of bone mesenchymal stem cells （BMSCs） treated with hypoxia plus serum deprivation were investigated. Bone mesenchymal stem cells were cultured with the whole marrow-adherence technique. RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of CXCR4. BMSCs were incubated in medium for 24 h with 10 ng/mL and 100 ng/mL SDF-1 respectively, and then they were treated with hypoxia plus serum deprivation for 6 h. Apoptosis rate was determined by flow cytometry and TUNEL method. The results showed that BMSCs had CXCR4 expression. The number of apoptotic cells was significantly reduced in SDF-1 PC group as compared with the control group, and 100 ng/mL SDF-1 PC group had the lowest level of apoptosis. It was concluded that SDF-1 preconditioning suppresses the apoptosis of BMSCs treated with hypoxia plus serum deprivation.     

染料木黄酮抑制血管内皮生长因子诱导的血管内皮细胞活化及蛋白激酶K活性

目的 探讨染料木黄酮(genistein,Gen)抗肿瘤血管生成的分子机制.方法 实验以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,通过锥虫蓝不相容试验测定Gen对HUVECs的细胞毒性,然后利用Caspase-3活性分析试剂盒测定Caspa...     

芍药醇对叔丁基过氧化氢损伤的血管内皮细胞的保护作用

目的：探讨芍药醇（PAE）对叔丁基过氧化氢（TBHP）损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分为对照组（Control组）、造模组（TBHP组）和PAE处理组（各浓度PAE+THBP组）;用CCK8法及乳酸脱氢酶（LDH）检测各组HUVECs细胞增殖抑制情况,Transwell实验检测细胞的迁移能力,流式细胞仪和Cleaved-caspase 3免疫荧光染色检测HUVECs细胞凋亡情况。结果：与Control组比较,TBHP组细胞存活率和细胞迁移数明显降低,细胞凋亡率、LDH释放量和Cleaved-caspase 3蛋白的表达明显升高（均P＜0.05）。与TBHP组比较,PAE处理组细胞的存活率和细胞迁移数均随着给药浓度的增加而逐渐升高,细胞凋亡率、LDH释放量和Cleaved-caspase 3蛋白的表达均随着给药浓度的增加而逐渐下降（均P＜0.05）。结论：PAE通过抑制TBHP诱导的HUVECs细胞存活率降低、LDH释放量升高、细胞凋亡增多、Cleaved-caspase 3蛋白表达的上调,发挥其对TBHP损伤的血管内皮细胞的保护作用,且呈剂量依赖性。     

VEGF对体外培养的人脐静脉内皮细胞Ets-1的诱导表达

目的：探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中转录因子Ets-1的诱导表达。 方法：原代培养获得HUVECs;应用细胞免疫化学染色技术及形态计量分析系统Image-Pro Plus（IPP）,检测VEGF对培养的内皮细胞Ets-1蛋白的诱导表达作用并对相关指标进行半定量分析。结果：VEGF（10 μg•L^-1）可诱导内皮细胞Ets-1蛋白的短时表达升高（P<0.01）,即随时间的延长,Ets-1表达也逐渐增强,在10 min时达高峰,30 min后Ets-1表达逐渐降低到无VEGF刺激的水平。 结论：VEGF可诱导人脐静脉内皮细胞中Ets-1蛋白的短时表达增加。     

PEDF对人脐静脉内皮细胞和肺癌SK-MES-1细胞增殖的影响及作用机制

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对SK-MES-1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响及可能的机制.方法 CCK-8法检测不同浓度PEDF在不同作用时间条件下对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度PEDF对此两种细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测PEDF对此两种细胞中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达水平的影响.结果 CCK-8结果显示,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞具有增殖抑制作用,呈一定浓度和时间依赖性(P<0.05);流式细胞术结果表明,实验组细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05),高浓度用药组凋亡率高于低浓度用药组(P<0.05);qRT-PCR结果表明,与对照组相比,PEDF能抑制HUVECs和SK-MES-1细胞中VEGF mRNA水平的表达(P<0.05).结论 PEDF的抗肿瘤作用主要包括抑制肿瘤血管生成和直接作用于肿瘤细胞两方面,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响可能与降低VEGF表达水平有关.     

Conditioned Medium from Human Umbilical Vein Endothelial Cells Promotes Proliferation,Migration, Invasion and Angiogenesis of Adipose Derived Stem Cells

Preeclampsia (PE) is a pregnancy-specific hypertensive complication, closely related to endothelial dysfunction. Adipose derived stem cells (ADSCs) have the capacity to differentiate into endothelial cells for vascular repair. Therefore, we hypothesized that induced endothelial differentiation of ADSCs might hold great potential for the treatment of PE. In this study, the primary ADSCs and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were isolated by the collagenase digestion method. The supernatant of HUVECs was collected from the first generation of cells. Then, ADSCs were divided into two groups: ADSCs alone group and induced ADSCs (iADSCs) group. In iADSCs group, ADSCs were induced by HUVECs conditioned medium and ADSCs special culture medium at a ratio of 1:1 over a two-week period. In order to identify the endothelial characteristics of iADSCs, CD31 and CD34 were examined by flow cytometry. The proliferation, migration, invasion and angiogenesis assays were employed to compare the bioactivity of iADSCs and ADSCs. Furthermore, The levels of angiogenic related factors including vascular endothelial growth factor (VEGF) and placenta growth factor (P1GF) were detected by RT-PCR and Western blotting. Results showed conditioned medium from HUVECs promoted ADSCs proliferation, migration, invasion and angiogenesis. In addition, the levels of VEGF and P1GF were significantly enhanced in iADSCs group. This study uncovered the iADSCs application potential in the therapy and intervention of PE.     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

人脂肪干细胞分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用

目的：分离培养脂肪干细胞（ADSCs）以探讨其分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用.方法：从人腹部脂肪组织中分离并培养ADSCs3d后,ELISA法测定ADSCs分泌血管内皮生长因子（VEGF）,肝细胞生长因子（HGF）含量;收集ADSCs培养液（ADSC-CM）作用于HaCaT细胞株.采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定HaCaT细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果：培养获得ADSCs细胞3d后,培养液中VEGF、HGF含量分别为（287±47）,（577±85）ng/L.MTT实验30%ADSC-CM组、50%ADSC-CM组的A490nm值分别高于对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）.实验组HaCaT细胞凋亡率明显低于对照组（P〈0.05）.与对照组相比较,实验组HaCaT细胞迁移距离36,48h时间点显著增大（P〈0.05或P〈0.01）.结论：ADSCs能分泌细胞因子且对HaCaT细胞具有促增殖、迁移和抑制凋亡作用.     

Targeted induction of differentiation of human bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells

A systematic method of isolating and culturing human bone mesenchymal stem cells （hMSCs）, and inducing them to differentiate into neuron-like cells in vitro was established. The hMSCs were isolated from bone marrow with the lymphocyte-separating medium, cultured and expanded in vitro, and induced after addition of compound neuro-revulsants. The morphological changes of hMSCs were observed, and the expression of surface markers in induced hMSCs was immunocytochemically identified during induction period. The hMSCs could be separated, cultured and expanded in vitro. After induction by compound neuro-revulsants for 48 h, the changes of neuron-like cells, such as cellular shrinkage and neurite growth, were observed in some cells. The immunochemical staining revealed nestin （＋） or NF （＋）, and GFAP （-）. It was concluded that hMSCs were successfully cultured and induced to differentiate into neuron-like cells.     

SDF-1α在体内对骨髓间充质干细胞的保护作用及其对缺血心脏修复的影响

目的：研究基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）在体内对移植干细胞的保护作用及能否提高干细胞移植对缺血心脏的疗效。方法：将用2μg/mL SDF-1α预处理过的干细胞与未处理组干细胞置于低氧无血清条件下6 h,用ELISA法检测VEGF的分泌。建立大鼠心梗模型,在梗死心肌与正常心肌边缘区注射50μL不含干细胞的IMDM（对照组,n=18）或含有3×106干细胞的IMDM（MSCs组,n=18）或含有3×106干细胞与2μg hSDF-1α的IMDM（SDF-1α＋MSCs组,n=18）。4 d后,用Western blot检测生存因子Bcl-2、磷酸化Akt4的表达,ELISA法检测VEGF及SDF-1α的表达量。4周后,接受心超检测、免疫组化染色。结果：SDF-1α蛋白能促进体内和体外环境下VEGF的分泌。Western blot证实经SDF-1α处理后,促生存因子Akt和Bcl-2表达增加。心梗后4周,相比单纯MSCs组而言,SDF-1α＋MCSs组能更多地促进新生血管的生成。但是在心功能方面,SDF-1α＋MCSs组和MSCs组没有明显差别。结论：SDF-1α能促进骨髓间充质干细胞的旁分泌作用,提高生存因子的表达,促进毛细血管新生,但未能加强干细胞移植对心功能的改善作用。