基因组DNA高通量提取技术及其在骨髓库捐献者样本HLA基因分型中的应用

本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminex rSSO HLA流式磁珠基因分型。使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用One lambda rSSO HLA—A、B和DRB1基因分型试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA—A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度。结果表明：从400μl全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3．217±0．715μg,A260／A280值平均为1．710±0．103,A260-A320／A280-A320值平均为1．761±0．151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本mA—A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁珠的荧光信号强度均〉600RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度〈50RFU。结论：本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验。     

自动工作站提取基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的研究和建立从大量全血标本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA流式磁珠基因分型。方法使用自动工作站(瑞士TECAN公司)从600μl全血中提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A,B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度。结果从600μl全血中提取基因组DNA,含量平均为10.052±0.824μg,样本的A260nm/A280nm值平均为1.821±0.201。琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb,HLA-A,B和DRB1位点PCR产物杂交后的平均荧光信号强度分别为2 183.84±478.12(exon2),2 168.28±338.59(exon3);2 057.27±397.41(exon2),1959.78±283.24(exon3);3 643.38±327.85。结论此方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验。     

DNA测序用于HLA常规分型方法难以确定样本的检测

由于中华骨髓库的建设推动了我国HLA分型检测技术的快速发展,从微量淋巴毒试验到SSP方法、到SSO杂交技术、再到基因芯片、DNA测序只经过了短短几年的时间[1-2].目前临床移植配型主要采用SSP方法,骨髓库建设则主要采用PCR-SSO荧光微珠流式杂交分型技术,该方法与SSP法相比,具有高通量、高分辨率、高可靠性等特点.但是由于现有的分型试剂均是以目前已经发现的基因序列为基础进行设计的,而且大多数是以西方人群资料为依据,在用来进行中国人群的HLA分型检测时不可避免的出现新的反应格局,有时无法与试剂盒所提供的判断模板相匹配,因而出现不确定的模棱两可结果.     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA流式磁珠基因分型。方法使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度。结果从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229。琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb。结论本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验。     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的 研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA 流式磁珠基因分型.方法 使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度.结果 从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229.琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb.结论 本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验.     

HLA基因测序分型技术的应用

[目的]对在骨髓库HLA基因分型和器官移植配型等工作中，应用PCR—SSP、PCR—SSO等方法不能确定结果的疑难标本进行测序，确认分型结果，寻找、发现新基因。[方法]测序方法采用双脱氧链终止法，引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂。[结果]对标本直接进行测序能够得到确切的HLA基因分型结果；对PCR—SSP、PCR—SSO等方法不能确定HLA基因分型结果的疑难标本进行测序，得到可靠的确认分型结果。[结论]HLA测序分型结果精确可靠，是HLA基因分型的金标准，能发现新基因。     

高通量测序技术在循环肿瘤DNA检测中的应用

目的 肿瘤是影响人类生命的重要威胁因素,肿瘤的早期诊断、预后及疗效评估有利于提高患者的生存率.目前临床上癌症的伴随诊断主要依靠肿瘤组织病理、内窥镜等检查,但都存在侵入性和异质性的问题.而在肿瘤细胞DNA中发生的分子变化如突变、易位和甲基化等,在循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)中也...     

HLA测序分型方法及其在造血干细胞移植中的应用

HLA基因位于人类第6号染色体短臂6p21．3区域，由一系列紧密连锁的基因座组成，具有高度的多态性，是迄今为止所知的人类最复杂的遗传系统。截止2007年4月，被WHO正式命名的HLA-Ⅰ类等位基因数为1839个，HLA-Ⅱ类等位基因数为875个，2者合计2714个。HLA基因编码的蛋白质主要功能是参与免疫应答中的抗原呈递，     

旋转离心柱提取全血DNA在HLA基因分型中的应用

目的采用旋转离心柱提取人类基因组DNA,能更好的适用于临床肾移植特别是尸肾移植的HLA基因分型。方法18份EDTA-K。抗凝的2ml全血标本分别采用标准酚一氯仿法、快速盐析法和旋转离心柱法提取DNA,做HLA-DR基因分型。然后就所获DNA浓度和纯度、操作时间、分型结果3个方面进行统计学分析。结果3种方法提取的DNA平均含量差异无统计学意义;采用旋转离心柱法和标准酚氯仿法提取的DNA纯度高于快速盐析法差异有统计学意义;整个操作时间旋转离心柱快于标准酚氯仿法和快速盐析法,差异有统计学意义;5份全血标本采用这3种方法获得的模板DNA基因分型结果完全相同,差异无统计学意义。结论采用旋转离心柱提取人类白细胞DNA,操作简单、快速,总耗时60～70min,分型方法稳定、可靠,无一例失败,能更好的适用于临床肾移植特别是尸肾移植的HLA基因分型。     

全自动工作站与两种人工抽提全血基因组 DNA 方法的比较

目的比较全自动工作站与两种人工法抽提全血基因组DNA的质和量,总结三种方法的特点及提供一些建议。方法三种方法均选取同样36份样本抽提基因组DNA,并比较其浓度和纯度,并计算三种方法所需的费用。结果三种方法提取的基因组DNA均能达到相关分子生物学实验的要求,但在操作程序、价格和全血需要量等方面都存在较大差异。结论全自动工作站用全血量少,价格比较便宜,适合大批量全血样本抽提基因组DNA。Gentra法和胍盐酸法均适用于新鲜全血和冻融过的全血,胍盐酸法还适用于有血凝块的全血。     

Rh phenotype prediction by DNA typing and its application to practice

The complexity of the RHD and RHCE genes, which is the greatest of all blood group systems, confounds analysis at the molecular level. RH DNA typing was introduced in 1993 and has been applied to prenatal testing. PCR-SSP analysis covering multiple polymorphisms was recently introduced for the screening and initial characterization of partial D. Our objective is to summarize the accrued knowledge relevant to the approaches to Rh phenotype prediction by DNA typing, their possible applications beyond research laboratories and their limitations. The procedures, results and problems encountered are highly detailed. It is recommended that DNA typing comprises an analysis of more than one polymorphism. We discuss future directions and propose a piecemeal approach to improve reliability and cost-efficiency of blood group genotyping that may eventually replace the prevalent serology-based techniques even for many routine tasks. Transfusion medicine is in the unique position of being able to utilize the most extensive phenotype databases available to check and develop genotyping strategies.     

DNA序列分析鉴定HLA-DRB1~*新等位基因DRB1~*1449

目的鉴定HLADRB1位点新等位基因。方法应用基因克隆和DNA测序技术对1例受检样本HLADRB1基因第2外显子(Exon2)作核苷酸序列分析,与已知等位基因序列比对并作血清学分型。结果基因组DNA和DNA克隆的测序结果一致;DRB1Exon2的核苷酸序列与已知等位基因序列均不相同,与同源性最高的HLADRB11432相比,存在4处碱基的改变;以Exon2的第1位碱基为记数起点,核苷酸71位C→>G,196位G→>A,244位T→>G和245位上G→>T,引起相应编码氨基酸28位上天门冬氨酸(Asp)→>谷氨酸(Glu),70位上精氨酸(Arg)→>谷氨酸盐(Gln),86位上缬氨酸(Val)→>氨基乙酸(Gly)。血清学分型结果表明新等位基因血清学特异性为DR14。结论被检标本HLADRB位点存在新等位基因,2005年2月WHOHLA命名委员会正式将其命名为HLADRB11449。     

多位点序列分型及其应用

多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列,分析菌株的变异。MLST操作简单,结果能快速得到并且便于不同实验室的比较,已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快和成本的降低,以及分析软件的发展,MLST逐渐成为细菌的常规分型方法。     

脐血造血干细胞移植的产前HLA配型研究

在脐血造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血患儿时,我们运用产前胎血进行HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学配型及HLA-Ⅱ类基因分型,以确定其是否为移植的合适供者。应用此法对11个家系进行了检测,结果发现其产前和产后的配型结果完全一致。依据此研究结果可以认为,HLA产前配型是用于脐血造血干细胞移植的一种可靠的、经济的方法。     

无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法的建立

目的建立从无限增殖化人类B淋巴细胞提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量。方法用DNA提取试剂盒提取基因组DNA;用紫外分光光度法测定DNA样本的纯度和产量;用琼脂糖电泳法测定DNA样本的完整性。结果(1~2)×107个B淋巴细胞提取基因组DNA的平均浓度为174±61.3 ng/μl,DNA的纯度平均为1.73±0.047(A260nm/A280nm),琼脂糖电泳测得DNA分子量约为21 kb,且无污染。结论该方法可以从无限增殖化人类B淋巴细胞提取高质量高浓度的基因组DNA。     

DNA序列分析鉴定HLA新等位基因B~*0740

目的确认一个中国人群中的新HLA等位基因。方法应用单倍型特异性分离(haplotype-specific ex-traction,HSE)技术和DNA序列分析技术鉴定HLA-B~*的新等位基因。结果被检标本HLA-B位点有一个等位基因的核苷酸序列与任何已知的HLA等位基因均不同,与同源性最高的B~*0705相比,在exon3区域中的605位碱基由A>T,引起编码178位的氨基酸由赖氨酸(K)变成甲硫氨酸(M)。血清学分型表明新等位基因的免疫学表型仍为HLA-B7。家系分析提示,HLA-B~*0740基因来源于其母亲。结论该等位基因序列为HLA-B位点的一个新等位基因,于2005年2月由WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B~*0740。