重组人肝细胞生长因子的纯化及鉴定

目的对重组人肝细胞生长因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｒ, ｒｈＨＧＦ）进行初步纯化及鉴定。方法 培养上清液经过离心、超滤,在ＦＰＬＣ系统上经肝素亲和层析分离纯化,用ＥＬＩＳＡ法检测、收集ｒｈＨＧＦ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电 泳鉴定纯度和相对分子质量,大鼠原代肝细胞培养法检测ｒｈＨＧＦ的生物学活性。结果ｒｈＨＧＦ主要在０．９～１．３ ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ 范围内被洗脱,由约６２ ０００和３４ ０００两个亚基组成,明显促进大鼠肝细胞ＤＮＡ合成。结论　经肝素亲和层析分离,从 表达山ＨＧＦ的ＣＨＯ细胞培养上清液中纯化出有活性的ｒｈＨＧＦ。     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法：应用RT—PCR从人肝细胞癌组织总RNA中扩增中期因子cDNA,将其克隆到表达载体pET-24a,在大肠杆菌中诱导表达,经肝素-琼脂糖亲和层析柱纯化,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。结果：构建的重组质粒pET—HMK能在大肠杆菌中高表达,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经肝素琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带,特异性抗体反应证实是重组人中期因子,细胞增殖试验显示其能育效促进NIH3T3细胞生长,并且具有剂量依赖性。结论：原核系统表达的重组人中期因子蛋白纯品具有刺激细胞增殖的活性。     

人胎盘肝细胞生长因子的提纯及其特性

①目的研究从人胎盘中提纯一种低分子量的肝细胞生长因子的实验方法及该因子的某些特性。②方法人胎盘匀浆液经高速离心后，上清液经分段盐析、阴离子交换层析、超滤和肝素亲和层析，纯化约６００～８００倍。③结果该生长因子是一种对热稳定、亲和肝素的蛋白质，分子量为１６．８７ｋｕ，能促进原代培养的成年大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成，其作用有剂量依赖关系，并能抑制小鼠Ｓ１８０细胞的ＤＮＡ合成。④结论人胎盘中存在一种特殊的肝细胞生长因子。     

人胎盘肝细胞生长因子的提纯及其特性

（１）目的研究人胎盘中提纯一种低分子量的肝细胞生长因子的实验方法及该因子的某些特性。（２）方法人胎盘匀浆液经高速离心后，上清液经分段盐析，阴离子交换层析，超滤和肝素亲和层析，纯化约６００～８００倍。（３）结果该生长因子是一种对热稳定，亲和肝素的蛋白质，分子量为１６．８７ｋｕ，能促进原代培养的成年大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成，其作用有剂量依赖关系，并能抑制小鼠Ｓ１８０细胞的ＤＮＡ合成。（４）结论人胎盘中存     

肝细胞生长因子和肝细胞生长抑制物质的分离

①目的用改良亲和层析法从人胎盘中分离肝细胞生长因子和肝细胞生长抑制物质。②方法取３０ｇ人胎盘加４倍体积（Ｗ／Ｖ）的缓冲溶液，匀浆，４℃，离心（１１０００ｒ／ｍｉｎ）３０ｍｉｎ，收集上清液；用４５％饱和度硫酸铵进行盐析。沉淀复溶后对洗脱缓冲溶液透析２０ｈ，再进行Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ凝胶过滤柱层析。最后，将层析第２峰过肝素－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ亲和层析柱，用改良的洗脱方法进行亲和层析。③结果在分离肝细胞生长因子的同时，还分离得到一种肝细胞生长抑制物质。肝细胞生长因子可明显刺激原代培养的大鼠肝细胞ＤＮＡ的合成（ｔ＝６４８．３９，Ｐ＜０．０１），而肝细胞生长因子则抑制原代培养的大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成（ｔ＝－１０．４４，Ｐ＜０．０１）。④结论改良亲和层析法在分离效率方面比传统方法有明显提高，而用该法分离到的肝细胞生长抑制物质可能参与了肝细胞的发育调节。     

亲和层析法纯化溶栓素

目的 :探讨亲和层析纯化溶栓素的方法。方法 :采用高碘酸钠法制备溶栓素抗体的亲和层析介质纯化溶栓素。结果 :提纯的溶栓素经聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE)鉴定为一条带 ,活性回收率为 49.5 %。结论 :亲和层析的高碘酸钠法是纯化溶栓素的一种分离速度快、特异性强、经济、安全可靠的方法 ,并适合于大规模纯化     

丹参素对原代培养大鼠肝细胞硫代乙酰胺损伤的影响

目的：观察丹参素对大鼠肝细胞硫代乙酰胺（ＴＡＡ）损伤的影响。方法：以体外原代培养大鼠肝细胞为模型，通过检测培养上清液中ＬＤＨ逸出量和四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）显色法了解肝细胞的存活及增殖情况，同时检测细胞内、外ＳＯＤ含量。结果：丹参麦在一定范围内呈剂量依赖性地刺激肝细胞增殖，而且能阻止ＴＡＡ引起的体外培养大鼠肝细胞ＬＤＨ逸了的增加、增生指数的下降以及细胞内、外ＳＯＤ活性的降低。丹参素对ＴＡＡ肝损伤和     

肝细胞、肝窦内皮细胞分离培养及肝细胞支架的制备

目的：探究大鼠肝细胞、肝窦内皮细胞的分离培养方法及肝去细胞支架的制备方法。方法：用胶原酶IV消化肝脏组织后经洗涤、过滤、离心等步骤分离出大鼠肝细胞,然后置于培养基内进行纯化、培养后行细胞免疫组织化学检测;通过Percoll密度梯度离心法分离出肝窦内皮细胞置于培养基内纯化、培养后行免疫荧光检测;肝组织经循环灌注去细胞处理制备成大鼠肝细胞去细胞支架后经扫描电镜证实。结果：分离出的大鼠肝细胞在显微镜下呈光亮圆形,饱满,胞核清晰。肝细胞细胞角蛋白18免疫组织化学染色后见胞浆内存在棕黄色颗粒。肝窦内皮细胞呈梭形,细胞核位于中央。内皮素-1免疫荧光染色后细胞表面呈红色信号。制备成的大鼠肝脏去细胞支架在扫描电镜下显示细胞外基质保留,无细胞核及细胞质成分。结论：成功分离出了肝细胞和肝窦内皮细胞并成功制备了肝去细胞支架。     

金黄地鼠原代肝细胞的分离纯化与培养

目的 建立一种简单、高效的金黄地鼠肝细胞分离、纯化及培养的方法.方法 实验采用两步胶原酶原位灌流法分离地鼠原代肝细胞,percoll离心法纯化细胞,台盼蓝染色检测成活率,对所分离培养的原代肝细胞进行形态学鉴定,Western Blot检测细胞功能.结果 经过分离纯化的金黄地鼠肝细胞,细胞成活率为（93.7％±2.1）％,细胞形态呈现不规则多边形,细胞多为双核和多核细胞.细胞在腺苷处理后,AMP激活的蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平明显升高.结论 成功建立了金黄地鼠肝细胞分离纯化及培养的方法.     

高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养

目的 :分离及培养高纯度的原代大鼠肝细胞。　方法 :用含EGTA的D Hanks液及含DNaseⅠ的胶原酶消化液分两步原位灌注大鼠肝脏 ,分离细胞经 3次低速离心 (5 0 g ,5min)后获得纯化的肝细胞。肝细胞存活率检测用锥虫蓝拒染法 ,纯度检测用苏木精 伊红染色。采用加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养 ,用倒置相差显微镜观察细胞活力。　结果 :每只 180～ 2 0 0 g的大鼠平均可获 (1.0～ 1.5 )× 10 8的细胞 ,存活率 >5 0 % ,纯度高于98%。培养 1、3、5天肝细胞的存活率分别为 10 0 %、94 .5 %、89.5 % ,形态良好。　结论 :改良原位灌注消化法分离肝细胞产率较高 ,活性较好 ,加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养能保持肝细胞良好的形态。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

肝细胞生长因子对ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成细胞外基质、基质金属蛋白酶及其抑制剂的作用

目的；观察重组人肝细胞生长因子（rhHGF)对常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD)囊肿衬里上皮细胞合成细胞外项质（ECM），基质金属蛋白酶及其抑制剂的作用。方法：采用放免法测定细胞合成层粘连蛋白（LN）和Ⅲ型前胶原氨基末端肽（PⅢNP），采用ELISA法检测细胞合成Ⅳ型胶原(ColⅣ），采用RT－PCR方法测定细胞表达转化生长因子β1（TGFβ1），基质金属蛋白酶2（MMP－2），金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP－1），金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP－2）mRNA的情况，用蛋白质印迹方法检测细胞上清液中MMP－2蛋白表达，明胶酶谱法检测MMP－2活性。结果：rhHGF及rhHGF 抗TGFβ1抗体组ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成LN，ColⅣ显著增多，但两组比较无显著差异。对照组，rhHGF组，rhHGF 抗HGF抗体组及rhHGF 抗TGFβ1抗体组各间合成PⅢNP值均无显著差异。对照组，rhHGF组，rhHGF＋抗HGF抗体组各组比较TGFβ1mRNA表达无显著差异。与对照比较，rhHGF显著上调细胞MMP－2 mRNA和细胞上清液中MMP－2蛋白表达及MMP－2活性，显著下调细胞TIMP－1，TIMP－2 mRNA表达。结论：HGF促进了ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成LN和ColⅣ，增加MMP－2表达，抑制TIMP－1，TIMP－2的表达。这些改变可能参与了ADPKD囊肿的发生及发展。     

丹参素对原代培养大鼠肝细胞硫代乙酰胺损伤的影响

目的：观察丹参素对大鼠肝细胞硫代乙酰胺（ＴＡＡ）损伤的影响。方法：以体外原代培养大鼠肝细胞为模型，通过检测培养上清液中ＬＤＨ逸出量和四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）显色法了解肝细胞的存活及增殖情况，同时检测细胞内、外ＳＯＤ含量。结果：丹参素在一定范围内呈剂量依赖性地刺激肝细胞增殖，而且能阻止ＴＡＡ引起的体外培养大鼠肝细胞ＬＤＨ逸出的增加、增生指数的下降以及细胞内、外ＳＯＤ活性的降低。丹参素对ＴＡＡ引起的肝细胞损伤的保护作用高于市场销售的乳猪促肝细胞生长素（ＰＨＧＦ）。结论：丹参素具有抗ＴＡＡ肝损伤和刺激损伤后肝细胞再生的作用     

中压液相层析法纯化人VLDL主要载脂蛋白

目的 建立中压液相层析分离法纯化人VLDL主要载脂蛋白(apo) E、CⅠ、CⅡ和CⅢ的方法.方法 以低温乙醇法制备人血浆白蛋白后的残余组分FⅡ Ⅳ为原料,经一次性密度梯度超离心得到VLDL.脱脂后的VLDL(apoVLDL)经中压Sephacryl S-200柱层析得到apoE和apoCs粗品.apoE经肝素琼脂糖CL-6B亲和层析进一步纯化,apoCs经DEAE-Sephacel离子交换层析进行分离.结果 apoE经肝素琼脂糖CL-6B亲和层析进一步纯化,可得纯度为93.8%的纯品;apoCs经离子交换层析分离得到纯度为92%以上的apoCⅡ、apoCⅢ.所纯化各载脂蛋白apo E、CⅠ、CⅡ及CⅢ经免疫单扩和SDS-PAGE鉴定为免疫纯及电泳纯.结论 成功建立了一种可大量、快速、高分辨分离提纯载脂蛋白apo E、CⅠ、CⅡ及CⅢ的方法.     

牛胎盘中肝细胞生长因子的纯化

用高速离心、分段盐析、亲和层析、超滤和阴离子交换层析法，从牛胎盘中分离纯化出一种肝细胞生长因子。结果表明，此因子的最终得率为０．００５ｍｇ／ｇ牛胎盘，其分子量约为９９ ０００ｕ，它能强烈刺激原始培养大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成。提示利用自制的亲和层析凝胶，通过此提纯流程可以得到一种肝细胞生长因子。     

牛胎盘中肝细胞生长因子的纯化

用高速离心、分段盐析、亲和层析、超滤和阴离子交换层析法，从牛胎盘中分离纯化出一种肝细胞生长因子。结果表明，此因子的最终得率为０．００５ｍｇ／ｇ牛胎盘，其分子量约为９９０００ｕ，它能强烈刺激原代培养大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成。提示利用自制的亲和层析凝胶，通过此提纯流程可以得到一种肝细胞生长因子。     

孕妇血清中早孕因子的分离与纯化

目的：建立一条从妊娠早期妇女血清中分离纯化早孕因子的技术路线，获得高纯度的早孕因子。方法：采用依次经过DEAE 52阴离子交换层析、SP Sepharose F．F阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl-6B亲和层析分离纯化的方案，最终得到具有早孕因子活性的Heparin-Ⅱ成分，早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有一条电泳区带，相对分子量为10．91kDa。结论：这条分离纯化早孕因子的技术路线是可行的，得到的相对分子量为10．91kDa的蛋白质为电泳纯的早孕因子。     

一种新型马鹿茸多肽纯化、鉴定及体外降血糖活性

从马鹿茸干品中分离具有降血糖活性的多肽。以新疆塔里木马鹿茸干品为原料,粉碎后经醋酸-醋酸钠(pH 3.5)缓冲液浸提,再经醇沉、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相色谱纯化多肽,并对该多肽进行MALDI TOF/MS相对分子质量检测和LC-MS/MS鉴定。MTT法检测促胰岛β细胞增殖和STZ损伤后修复能力以及建立肝细胞胰岛素耐受模型检测该多肽促肝细胞葡萄糖消耗量活性。结果表明,分离纯化得到的多肽CAP经MALDI-TOF/MS检测,其相对分子质量为6 804,LC-MS/MS及相关数据库比对发现,CAP为一种新的肽。CAP能显著促胰岛β细胞的增殖和STZ损伤后的修复,并能显著增加肝细胞的葡萄糖摄入量。     

大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究

目的 建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和KT-PCK分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR 分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.