SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白，并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因，并在原核系统中表达GST-M融合蛋白．用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白，并在Mr=52000附近出现特异性结合带；而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白，它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应，为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。     

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的：获得纯的重组SARSCoV M蛋白，并初步测定重组蛋白的抗原性。方法：软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断，体外合成编码SARSCoV M蛋白15．170aa序列的DNA片段，利用DNA重组技术，将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒pGEX．SARSCoV M。在大肠杆菌BL2l中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白，分离纯化GST-SARSCoV M蛋白，利用纯化蛋白作为抗原，建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体。结果：GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD，纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体，53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体。结论：SARSCoV M蛋白表达成功，在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体。     

SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoV N蛋白。结果肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞/巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoV N蛋白单克隆抗体均为阳性。结论SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoV N蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达,对研究SARS-CoV传播途径具有重要意义。     

湖南省不同人群SARS冠状病毒抗体血清流行病学研究

目的通过开展高暴露人群、本地健康人群及从SARS流行地区返湘的流动人群的SARS血清流行病学调查，了解他们感染SARS冠状病毒的状况，阐明我省SARS流行和波及的范围，为今后的科学防治提供依据。方法于2003年5—8月选择病例的家庭密切接触者、接诊SARS确诊病例的医务人员、各级疾病预防控制机构现场处置工作人员、果子狸等野生动物接触人员、5个县健康人群及SARS流行期间从流行地区返湘的流动人群为调查对象，采集调查对象的血清标本，用ELISA法检测SARS冠状病毒IgG抗体。结果共检测血清标本805份，SARS冠状病毒抗体阳性率为0．50％，其中以家庭密切接触者的阳性率最高，为8．70％，其次流动人群的阳性率为0．65％，其他人群的阳性率均为0。结论家庭密切接触者的SARS冠状病毒抗体阳性率显著高于其他人群，支持近距离飞沫传播和密切接触是SARS的主要传播途径；我省不同人群SARS冠状病毒抗体阳性率均低于广东的报道，且医务人员、疾控人员及健康人群的SARS冠状病毒抗体阳性率均为0，证实SARS在传人我省后，及时得到有效控制，未造成流行和波及其他人群；野生动物接触人员的SARS冠状病毒抗体阳性率为0，说明目前还没有证据显示我省野生动物携带SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

SARS病人SARS冠状病毒核壳抗原抗体的变化规律

OBJECTIVE: To assess serum antibody responses of patients with severe acute respiratory syndrome (SARS) to nucleocapsid (N) antigen of SARS-associated coronavirus. METHODS: The serum levels of IgM and IgG antibodies to N antigen were measured in 200 healthy blood donors and 13 SARS patients at different time points of acute and convalescent phases using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with N fusion proteins of SARS-associated coronaviruses. RESULTS: The IgM positive critical value of 0.233 and IgG of 0.239 were selected as the threshold value for positive results that equals the product of 2.1 and the mean IgM and IgG levels of 200 healthy blood donors. In 13 patients with SARS, the antibody responses to N antigen were not detectable in the first week after the onset of symptoms. The IgM and IgG seroprotection rates were 83.3% and 66.7% respectively in the second week, both reaching 100% at the third week. IgM seroprotection rates was 61.5% in the second month, and 38.5% at third month. The IgG peaked one month after the onset and remained at high levels in the following 2 months. CONCLUSION: The antibody responses suggest that N protein of SARS is immunodominant and plays an important role in viral pathogenesis. This ELISA-based test for detecting anti- N antigen may be of significant value for SARS diagnosis.     

SARS患者血清中SARS相关冠状病毒抗体产生规律的初步分析

目的 :了解严重急性呼吸综合征 (SARS)患者血清中 SARS病毒特异性 Ig M、Ig G抗体产生的规律。方法 :随机选取32例 SARS患者 5 5份血清标本 ,应用 EL ISA分别检测抗 SARS病毒 Ig M、Ig G抗体。结果 :Ig M抗体阳性率为 5 6 .4 % ,平均出现时间为 (5 .88± 2 .6 2 ) d,其中 2例患者在发病后第 2天即出现阳性 ,平均消失时间为 (14 .2 5± 2 .97) d;Ig G抗体阳性率为4 1.9% ,平均出现时间为 (11.4 0± 4 .2 0 ) d,其中 2例患者在发病后第 3天即为阳性 ;Ig M和 Ig G抗体的总体阳性漏检率为6 .2 5 %。结论 :SARS患者于发病后 3～ 7d血清中出现特异的 Ig M抗体 ,可用于实验室诊断 ;同时进行 Ig M和 Ig G抗体的检测可用于发病 8～ 14 d左右的实验室排查检测     

SARS冠状病毒M基因膜内区的克隆、表达与鉴定

目的对SAILS冠状病毒M蛋白膜内部分（Mc蛋白）的基因（Mc区）进行克隆、表达及鉴定。方法采用PCR技术从SAILS-CoV GD322株M基因全长片段上扩增得到Mc区,克隆至pGEM-T载体。利用引物上的EcoR I／Xho I酶切位点切下Mc区插入至pET-32a（＋）表达载体,转化原核表达系统BL21,表达His-融合蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定。结果扩增的Mc区长度为360bp,重组子经PCR,双酶切和测序鉴定,获得pET-32a（＋）／Mc原核表达菌株并可进行高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot验证为相对分子质量约43000的融合蛋白,与预期理论值相符。结论实现了Mc蛋白的高效表达,为进一步研究SAILS冠状病毒Mc蛋白的生物学作用奠定了基础。     

SARS冠状病毒全基因组突变初步分析

截至2003年5月12日，世界各地向GenBank已经提交了12条SARS冠状病毒的全基因组序列(新加坡5条、香港3条，北京1条，美国1条，加拿大1条，台湾1条)。我们收集了相关的数据，并对这12条序列(表1)做了比对分析，试图考察SARS冠状病毒自SARS流行以来有无大规模的转型，是否出现比较有意义的突变。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上,筛选重组子,通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌     

人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。     

SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测

目的从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.     

人神经营养素-3成熟区基因在大肠杆菌内的表达

【目的】应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为探讨其对阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病的治疗作用提供材料。【方法】将通过序列分析确定的hNT 3成熟区基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体 pBV/mhNT 3 ,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定表达蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。【结果】pBV/mhNT 3可在大肠杆菌中表达出一相对分子质量为 15× 10 3 的新蛋白 ,与hNT 3蛋白相对分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的生长。【结论】人神经营养素 3成熟区基因可在大肠杆菌内高效表达hNT 3。     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8．1编码基因，并置于大肠杆菌中作融合表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增出K8．1编码基因，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含K8．1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8 K8．1序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论：HHV-8K8．1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。     

Construction of Shuttle Expression Plasmid and Stable Expression of Foreign Gene in Mycobacteria and E．Coli

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳｈｕｔｔｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄａｎｄＳｔａｂｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ＦｏｒｅｉｇｎＧｅｎｅｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄＥ．ＣｏｌｉＨＵＡＮＧＦＵＹｏｎｇ－ｍｕ（皇甫永修）；ＺＨＡＮＧＤａ－ｊｕ...     

Expression and Purification of SARS Coronavirus Membrane Protein

To construct a recombinant plasmid Pet23a-M, the gene encoding severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus membrane protein was amplified by RT-PCR and cloned into the expression plasmid Pet23a. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA sequencing analysis revealed that the cloned DNA sequence was the same as that reported. The recombinants were transformed into Escherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) and induced by Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of 27 kD (1 kD=0. 992 1 ku) protein was detected by SDS-PAGE and pured by metal chelated chromatography. Results of Western-blot showed that this expressed protein could react with antibodies in sera of SARS patients during convalescence. This provided the basis for the further study on SARS virus vaccine and diagnostic agents.     

SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。