重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

人骨形成蛋白2,3成熟肽削短/突变体的构建与表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白［1］(bone morphogenetic proteins, BMPs)是属于TGF-β超家族的成员,目前已有18个hBMP基因被克隆. 除BMP-1外,其他BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用［2-4］,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景. 利用E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性［5,6］,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系,尚未见报道. 在上述工作的基础上,本研究在大肠杆菌中表达削短和突变的hBMP-2,3成熟肽,测试其活性,以探索其结构与功能的关系,并期望为获得更好的新型的基因工程hBMP2,3提供依据,为深入研究hBMP-2,3生物活性的分子机制和临床应用打下基础.     

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达．方法：从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT—PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达．结果：获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总蛋白的41．5％．结论：采用分子克隆的方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达。     

人骨形成蛋白2，3成熟肽削短／突变体的表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白 [1 ] (bone morphogenetic proteins,BMPs)是属于 TGF-β超家族的成员 ,目前已有 18个 h BMP基因被克隆 .除 BMP- 1外 ,其他 BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用 [2 - 4 ] ,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景 .利用 E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性 [5 ,6 ] ,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系 ,尚未见报道 .在上述工作的基础上 ,本研究在大肠杆菌中表达削…     

人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

目的克隆和构建人骨形成蛋白2(BMP-2)和人骨形成蛋白7(BMP-7)成熟肽真核表达载体。方法采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

大肠杆菌表达的重组人骨形成蛋白—3C端肽的纯化

目的：在用大肠杆菌表达人骨形成蛋白－３羧基端肽段获得成功的基础上，进一步探讨ｒｈＢＭＰ－３Ｃ的纯化方法。     

人骨形成蛋白2和7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

[摘要] 目的 克隆和构建人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽真核表达载体。方法 采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果 总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论 成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

人era基因的克隆测序及表达

目的 克隆人的ｅｒａ基因（简称Ｈｅｒａ）开利用大肠杆菌进行表达。方法 ＰＣＲ扩增Ｈｅｒｑ基因,正确后克隆入大肠直菌融合表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ３,受控于Ｐｔａｃ启动子,重组质粒ｐＧＥＸ－Ｈｅｒａ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌,用ＩＰＴＧ进行诱导表达。结果 克隆了Ｈｅｒａ基因,测序正确,含重组质９粒ｐＧＥＸ－Ｈｅｒａ的菌体诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带,相对 分子质量为６５ｋｕ,占菌体总蛋白     

BM P-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法 根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用One step RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果 琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示一长约451bp的条带。阳性克隆质粒经双酶切可切出约451bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论 利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.     

Expression of the human era cDNA in E.coli

Objective: To amplify human era (Hera) gene, then express it in E.coli. Methods: Human era gene, after amplified by PCR and identified by sequencing, was inserted into the expression vector pGEX-4T3 in which exogenous gene was controlled by Ptac promoter. The recombinant plasmid pGEX-Hera was transformed into DH5 ( and induced with IPTG chemically. Results: The human era gene was amplified and the sequence was correct. When the bacteria with pGEX-Hera was induced, an anticipated 65 000 protein band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to 23% of total bacterial protein. Conclusion: The human era gene has been successfully amplified and efficiently expressed in E.coli.     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。     

人神经营养素-3全长基因克隆及序列分析

目的: 扩增人神经营养素-3(human neurotrophin-3,hNT-3)全长基因并进行序列分析。方法: 应用聚合酶链反应技术,以一个健康成人基因组DNA为模板,扩增出编码hNT-3的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序。结果: 所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,除hNT-3中第555位碱基由C→T外,余序列同已知序列完全一致,改变的碱基并不影响基因编码的氨基酸序列。结论: 成功地获得了hNT-3的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.     

猪囊尾蚴GP50编码基因的克隆和序列分析

目的:从猪囊尾蚴cDNA中扩增出GP50编码基因,亚克隆至真核表达载体,利用所得的重组蛋白建立一种灵敏检测猪囊尾蚴感染的实验方法。方法:设计并合成引物,从猪囊尾蚴cDNA文库中PCR扩增GP50编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后,软件分析所获的目的基因。结果:PCR法扩增出897 bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-GP50作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,得到与PCR扩增产物一致的插入片断,表明GP50编码基因具有一个长度为897 bp的完整开放阅读框,编码298个氨基酸,相对分子量33 000,与GenBank收录(编号为AY212945)的猪囊尾蚴GP50编码基因具有高度的同源性(99%)。结论:猪囊尾蚴GP50编码基因的克隆获得成功。