内皮素受体B基因启动子上游CpG岛甲基化对神经嵴细胞迁移的影响

目的 探讨内皮素受体B(EDNRB)基因启动子上游CpG岛甲基化对肠神经系统(ENS)发育中神经嵴细胞迁移的影响.方法 采用甲基化特异性PCB(MSP)技术检测2007年9月-2008年12月华中科技大学同济医学院附属协和医院经病理检查等证实的16例先天性巨结肠症(HD)患儿挛缩段组织标本中EDNRB基因启动子上游cpG岛甲基化状态;采用荧光定量PCR(SYBRGreen法)检测HD患儿病变组织标本(包括扩张段、移行段和挛缩段3段组织)中EDNRB基因mRNA的相对表达量.并收集同期16例非HD患儿的正常结肠组织标本作为对照.结果 HD患儿挛缩段标本行MSP检测,甲基化率为12.5%(2/16例);非HD患儿正常组织均未发现甲基化.16例HD患儿病变组织标本(包括扩张段、移行段、挛缩段)荧光定量PCR检测发现2例甲基化病变组织标本(包括扩张段、移行段、挛缩段)中EDNRB基因表达水平较非甲基化组织明显下调,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在HD发病机制中,EDNRB基因启动子上游CpG岛甲基化可能对ENS发育中神经嵴细胞的迁移有一定影响.     

先天性巨结肠层粘连蛋白的表达及与RET基因相关性的研究

目的通过对层粘连蛋白（LN）、层粘连蛋白基因、RET基因在先天性巨结肠（HD）病儿狭窄段、移行段、正常段的表达研究，探讨HD的病因。方法用二步法对27例HD患儿狭窄段、移行段、正常段肠壁组织进行免疫组织化学染色，RS Image成像系统照相，JD801形态学图像分析软件判定阳性染色面积；用RT-PCR技术对LN基因及RET基因在三段肠壁的表达定性研究，美国alpha9900凝胶图像分析系统进行强度表达；用实时荧光定量PCR技术对LN基因及RET基因在三段肠壁的表达定量分析，采用7000型SDS应用软件相对定量2^△△Cr法比较各基因的表达差异；相应数据用SPSS11．5软件统计分析，推断LN的表达与HD的关系，并分析两基因表达的相关性及与HD发生的关系。结果层粘连蛋白及其基因在狭窄段表达明显增高，从狭窄段到正常段逐渐减低；而RET基因在狭窄段表达明显减低，从狭窄段到正常段逐渐增高，两者呈负相关。结论层粘连蛋白在无神经节细胞段表达增高是内在的，它引起肠壁神经嵴细胞的过早成熟定居导致HD的发生。层粘连蛋白基因与RET基因的表达呈负相关关系，对HD的形成两者可能存有某种内在的联系。     

先天性巨结肠症致病基因的研究进展

先天性巨结肠症(Hirschsprung,sdiseaseHD)是一种以肠道末端神经节细胞完全缺如为特征的消化道畸形,其发病率为1/5000。有关HD的病因目前尚不完全清楚,但大多数认为本病属多因子遗传性疾病,即由遗传和环境因素共同作用所致。这些因素包括、遗传、缺血、缺氧、病毒、炎症等。近年来,随着分子遗传学的不断发展,对HD的病因及发病机制有了更深入的认识,进一步明确了HD是具有多基因遗传特性的先天性发育畸形。迄今发现与HD发病相关的基因主要有RET原癌基因(RET)、内皮素3(EDN3)、内皮素B受体(EDNRB)、胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)…     

同源异型框基因在先天性巨结肠中的表达

目的探讨Pitx2、Hox-3．5mRNA的表达与先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）发病的关系及其对胚胎发育的作用和影响。方法取常见型HD60例不同病理形态学肠段组织标本，同时Wistar大鼠消化道畸形动物模型正常对照组10只（N）、VitA缺乏组10只（A）、妊娠第11天补充VitA组10只（B）和妊娠第7天补充VitA组10只（C）各组消化道组织标本。应用RT-PCR方法检测Pitx2、Hox-3．5 mRNA表达情况。结果Pitx2在常见型的痉挛段、移行段和扩张段肠管组织中mRNA高表达（表达率分别为86．7％、78．3％和56．7％）；Hox-3．5在常见型的痉挛段、移行段和扩张段肠管组织中mRNA高表达（表达率分别为91．7％、81．6％和68．3％）。而在HD正常段肠管中Hox-3．5mRNA低表达（11．7％），Pitx2无表达，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论Pitx2、Hox-3．5基因可能是影响胚胎发育、神经节细胞发育不全，而导致HD的原因之一；Pitx2和Hox-3．5在动物胚胎发育中的作用是一个非常复杂的过程，这两种与发育有关的基因必须以一个严密而有序的方式相互协调和作用才能完成各种类型的细胞在特定地方的生长分化，继而形成特定的组织。     

先天性巨结肠内皮素B受体基因突变的研究

目的：研究先天性巨结肠（HD）的发生与内皮素B受体基因（EDNRB）突变间的关系。方法：40例HD患儿（37例散发性和3例家族性）和40例无便秘正常健康对照者,分别抽取外周静脉血3ml并经盐析法提取DNA,然后运用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）银染色法检测EDNRBG中的第4、5、6外显子（E4、E5、E6）的突变情况,并对阳性片段进行DNA测序。结果：37例散发型中的1例短段型HD患儿E4扩增片段在SSCP分析时发现有泳动变位,而且该样品DNA测序核苷酸位点831密码子277位点上出现G→A的置换,证实为同义突变。结论：EDNRB基因突变与中国人HD的发生有密切关系,且主要为短段性HD。     

用实时定量PCR和DGGE技术检测先天性巨结肠SIP1基因的表达与异质性

目的 建立简单、有效的SIP1基因在先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HD)中表达情况及异质性筛查技术,并获取其相应的散发性HD人群频率分布.方法 采用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 方法 检测180例HD及正常人外周血SIP1基因的mRNA 转录水平;采用PCR-DGGE(PCR degenerating gel gradient elactrophoresis, PCR-DGGE)法检测SIP1基因外显子1-rs11544569和外显子2-rs57148397的异质性.结果 SIP1基因在62.2%(112/180)的正常人和90.5%(163/180)的HD中阳性表达.HD患儿中SIP1基因在mRNA转录水平的表达均高于正常人外周血(P＜0.05). rs11544569和rs57148397两位点分别有104例和119例HD观察到异质性,其发生率为57.8%和66.1%.180例正常人中均未发现异常电泳条带.结论 检测SIP1 mRNA 含量可作为判断HD的良好参考指标.PCR-DGGE是一种简单、灵敏、高效的SIP1基因多态性及异质性检测技术,可应用于医学实践.     

先天性巨结肠症SIP1基因外显子3和外显子4的突变分析

目的 探讨SIP1基因外显子3和外显子4与散发性先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HD)的关联性.方法 检测150例HD患儿SIP1基因突变.采用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-degenerating gel gradient electrophoresis,PCR-DGGE)与DNA测序法检测患儿SIP1基因exon3 and exon4的突变.另选取150例正常人(排除家族性顽同便秘及其他先天性消化道畸形史健康儿童)外周血DNA作为对照组.结果 在HD组exon3 PCR-DGGE发现83例异常电泳条带,测序证实67/83例SIP1发生在突变集中区域,为错义突变(ACC→ATC,苏氨酸→异亮氨酸).在HD组exon4发现101例异常电泳条带,测序证实68/101例SIP1发生在突变集中区域,有4种突变(CAC→TAC,组氨酸→酪氨酸;GAG→GAT,谷氨酸→天门冬氨酸;GCC→GTC,丙氨酸→缬氨酸;TGT→TTT,胱氨酸→苯丙氨酸).DGGE检测正常对照组中未发现异常电泳条带,测序未发现突变.结论 SIP1基因为HD的致病基因,突变类型多样,已发现热点突变;提示SIP1基因与HD发病存在一定程度的关联.     

SOX10基因在先天性巨结肠患儿肠壁中的表达

目的研究先天性巨结肠(HD)肠壁中性别决定区Y基因相关高可变区基因10(SOX10)的表达,了解HD在分子基础上的发病机制。方法分别取50例HD病例的手术标本狭窄段、移行段及扩张段为病例组,另随机取50例非HD手术病例标本作为对照组,提取其平滑肌组织总RNA,应用反转录(RT)-PCR扩增目的基因和看家基因片段,观察其病变段和正常段SOX10 mRNA的表达,并与看家基因在病变段和正常段的表达进行比较,并进行统计学分析。结果 SOX10 mRNA在HD患儿痉挛段(0.186 19±0.007 84)呈低表达,在扩张段(0.506 94±0.006 31)及对照组(0.594 35±0.006 29)呈高表达,痉挛段SOX10 mRNA的表达量与移行段(0.314 71±0.016 57)、扩张段及对照组比较,差异有统计学意义(F=16 384.220,P=0.000);而移行段、扩张段与对照组比较,差异亦有统计学意义(F=8 666.046,P=0.000)。结论 HD患儿结肠SOX10 mRNA的异常分布显示SOX10基因是出生后肠神经系统维持正常功能所必需的,SOX10 mRNA表达减少可引起肠管痉挛、狭窄,造成肠功能障碍。     

先天性巨结肠RET基因启动子多态性及其意义

先天性巨结肠(Hirschsprung's disease,HD),是小儿外科常见疾病,亚洲人种发病率最高[1].近年来研究发现RET基因多态性与HD发病有关[2,5],本课题拟通过研究浙江省HD的RET基阑启动子(promotor)单核苷酸多态性(single nueleotide polymorphism SNPs),分析其单倍型,并通过免疫组化研究启动子多态性对RET蛋白表达的影响.     

P2Y1受体基因在先天性巨结肠中的表达及其意义

目的 探讨嘌呤P2Y1受体与先天性巨结肠(HD)发病的关系.方法 选取郑州大学第三附属医院小儿外科20例HD患儿手术切除结肠的狭窄段和扩张段全层组织.20例HD患儿均根据临床症状、体征、钡灌肠、术中所见及病理检查证实为HD.男13例,女7例;手术年龄为10 d～2岁,平均4个月.常见型13例,长段型5例,短段型2例.另取20例直肠黏膜脱垂切除的正常结肠组织作为对照.采用反转录(RT)-PCR检测P2Y1受体基因在所取标本中的表达.结果 P2Y1受体基因在HD狭窄段肠管全层无表达(表达阳性率为0),其在HD扩张段表达减少(阳性率为45%),在正常肠管组织正常表达(阳性率为86.5%).P2Y1受体基因在狭窄段表达水平与其在扩张段和正常结肠组织的表达水平差异均有统计学意义(Pa=0.000);P2Y1受体基因在HD扩张段肠管表达水平与其在正常肠管表达水平比较差异无统计学意义(P=0.914).结论 P2Y1受体基因在结肠中表达缺乏可能是HD发病的重要原因之一,同时也是肠动力障碍的一个重要原因.     

中国人散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因的研究

目的 研究中国人散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因的特征，探讨内皮素受体B基因与先天性巨结肠症发病的关系。方法 收集散发性先天性巨结肠症病例75例和正常对照40例，通过盐析法从外周血中提取DNA，应用聚合酶链反应-单链构象多态性和变性高效液相色谱技术，对内皮素受体B基因的第1a、1b和4外显子进行分析，并通过DNA测序确定阳性样本的碱基改变方式。结果 6个病例在第4外显子上存在多态性改变，改变方式均为碱基75487位点上G→A的置换(Leu277→Leu)，发生率为8．0％(6／75)。正常对照样本该位点没有此种变化。所有病例的第1a、1b外显子均无异常改变。结论 中国人散发性先天性巨结肠症患儿中可检测到内皮素受体B基因的多态性改变，内皮素受体B基因是先天性巨结肠症的易感基因。     

腹腔镜先天性巨结肠症手术操作指南(2017版)

一、前言 先天性巨结肠症(Hirschsprung's disease,HD)又称为肠无神经节细胞症,是导致新生儿肠道梗阻和婴幼儿便秘的常见原因,其特点是肠管的黏膜下神经丛和肌间神经丛神经节细胞缺如,肠管丧失蠕动功能,导致肠道梗阻.HD的活产发病率约为1/5 000,病因不明,但已经公认HD是一种复杂先天性疾病,该病与基因结构异常有关[1-3].     

大鼠胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共重组腺病毒的构建及表达

目的构建胶质细胞源性营养因子（GDNF）及内皮素B受体基因（EDNRB）共表达腺病毒并观察其在神经干细胞（NSC）中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建GDNF及EDNRB基因共表达腺病毒AdGE，体外感染NSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、流式细胞仪法鉴定外源基因的表达。结果NSC经Ad—GE感染后24h可观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR、流式细胞仪法证实外源性GDNF及EDNRB基因均可在NSC中表达。结论成功构建GDNF及EDNRB基因共表达重组腺病毒，证实了其在NSC的表达，为先天性巨结肠的联合基因治疗打下基础。     

缝隙连接蛋白43在先天性巨结肠肠壁中的分布

目的观察缝隙连接蛋白43（Cx43）在先天性巨结肠症（HD）肠壁中的分布，探讨Cx43与HD发病的关系。方法运用免疫组化法观察30例HD患儿及30例对照组肠壁中Cx43的分布情况。患儿男26例，女4例，年龄1个月～8岁。其中短段型1例，普通型20例，长段型5例，全结肠型4例。另取3例新鲜组织在电镜下观察缝隙连接的分布情况。结果HD无神经节细胞肠段肠壁内Cx43的表达消失，与HD有神经节细胞肠段及对照组相比，具有显著性差异（P〈0．01）。HD有神经节细胞肠段肠壁环肌层及肌间层有阳性至强阳性的Cx43表达，纵肌层偶有表达或表达缺失，与对照组无显著差异（P〉0．05）。电镜下在HD无神经节细胞肠段未见缝隙连接的超微结构，而HD有神经节细胞肠段可见其存在。结论Cx43的表达缺失或减少，及缝隙连接结构的破坏可能与HD的肠动力障碍的发病机制有关。     

全结肠巨结肠肠壁内神经标志物表达及神经支配的研究

目的通过免疫组织化学染色研究不同神经标志物在全结肠型无神经节细胞症（TCA）和常见型巨结肠（HD）肠壁内表达的差异。方法复旦大学附属儿科医院1996年1月～2005年12月间收治TCA确诊病例18例，收集结肠、回肠全层标本。对照组为常见型HD及肛门直肠畸形各10例。采用免疫组织化学染色技术对肠壁内神经标记物：S-100蛋白、外周蛋白、蛋白基因产物9．5（PGP9．5）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的不同程度的表达进行比较。数据采用t检验分析。结果PGP9．5、S-100蛋白、NSE和外周蛋白在对照组和TCA组、HD组近端肠壁内表达差异无统计学意义（P〉0．05）；移行段内可见少数成熟和不成熟神经节细胞，神经标志物表达低于HD组（P〈0．01）；18例TCA远端肠壁内均无神经节细胞，粗大的神经干较HD少见，神经标志物表达明显低于HD组（P〈0．01），以PGP9．5最明显。结论研究表明TCA和常见型HD病变肠段中存在明显的神经标记物阳性表达差异，提示全结肠巨结肠肠壁内神经支配异常不同与常见型巨结肠。     

RET蛋白、NCAM在先天性巨结肠中表达的意义

先天性巨结肠症（Hirschsprung＇s disease，HD）是因神经节细胞不能在肠壁内聚集、定位和分化等因素导致肠壁内神经节细胞缺如。对两因素以及两因素之间在形成HD共同作用的研究未见报道。本文利用免疫组织化学的方法，同时观察HD病例中RET蛋白、NCAM在无神经节（aganglion，AG）肠段和有神经节（ganglion，NG）肠段的表达，探讨二者之间以及二者本身在HD致病机制中所起作用。为HD的研究提供一种新的思路。     

小儿急性白血病IgH基因重排

小儿急性白血病ＩｇＨ基因重排李戈符仁义廖清奎李兰郭俊可微量残留病（ＭＲＤ）是导致急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）复发的根本原因，但临床难以检测＜１％的残留白血病细胞。我们采用基因重排原理，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测２５例Ｂ细胞急性淋巴细胞白血病（...     

先天性巨结肠症的诊治现状

先天性巨结肠症（HD，Hirschsprung’disease）是一种肠神经发育障碍性疾病，特点是肠管肌间神经丛和黏膜下神经丛中缺乏神经节细胞。HD在男性儿童中更常见，80％～85％的患者无神经节细胞，病变局限于直肠和乙状结肠，10％的患者病变累及更近端的结肠，5％～8％的全结肠HD患者病变可累及小肠的不同水平。以下介绍HD诊断和治疗的现状、进展以及一些焦点问题。     

先天性巨结肠症及其同源病神经标志物的表达以及图形测量定量研究

目的免疫组织化学方法检测4种肠道神经标志物在正常结肠、先天性巨结肠症（HD）、神经元发育不良-B（IND-B）及神经节细胞减少症（HG）病变结肠的表达特点，并采用图像分析技术对肠道神经系统进行定量分析。方法组织蛋白酶D、蛋白基因产物9．5、S-100蛋白和外周蛋白4种抗体，对10例正常结肠、20例HD、8例IND-B型及20例FIG的患儿结肠石蜡标本切片采用过氧化酶标记的链霉卵白素免疫组织化学染色。ImageJ图像处理软件对所有数码图像（×400）中神经丛、节细胞计数以及节细胞形态进行定量测量。结果组织蛋白酶D仅在神经节细胞表达阳性，不表达于神经纤维；PGP9．5和外周蛋白在肠壁肌间、黏膜下神经丛及神经节细胞中均有阳性表达；S-100在神经节细胞中表达阴性。定量分析：HD病变肠段缺乏神经节细胞；IND-B病变肠段肌间神经节细胞与正常比较计数明显增多，节细胞直径以及细胞核直径分别为正常的1．22倍和1．34倍（P〈0．01）；HG病变肠段神经丛内节细胞数量明显减少（P〈0．05）。结论免疫组织化学染色图像分析技术使不同病变间的形态差异得到定量分析，有助于对HD和同源病的病理学研究以及临床诊断和鉴别诊断。     

S-100蛋白与Cathepsin D在先天性巨结肠诊断中的应用

目的观察S-100蛋白(S-100)和组织蛋白酶D(cathepsin D，CAD)在先天性巨结肠(Hirschspnmg’s disease，HD)中的表达。方法应用免疫组织化学染色观察25例HD患儿及10例对照组儿童结肠。结果(1)在正常对照组与HD扩张段组肠壁肌间和黏膜下层可见CAD只对神经丛中神经节细胞阳性表达，对神经纤维与神经胶质细胞均不表达。S-100染色与CAD染色相反，神经纤维与神经胶质细胞均阳性表达，神经节细胞阴性表达，表现为阳性神经丛中细胞状“空白区”。(2)在HD狭窄段组肠壁神经丛中缺乏CAD阳性表达。S-100染色神经丛中细胞状“空白区”未观察到；S-100强阳性表达的神经纤维束显著增生，扭曲呈波浪状。结论S-100和CAD的免疫组化染色对诊断HD具有重要意义。