淋球菌外膜Porin I蛋白多价抗血清的制备及其临床应用初探

目的 制备淋球菌外膜GST-PI融合蛋白多价抗血清,并探讨该多价抗血清与临床泌尿生殖道分泌物标本的结合情况.方法 重组的淋球菌外膜GST-PI融合蛋白免疫家兔,获得多价抗血清;并用双向免疫扩散法鉴定家兔多价抗血清的效价.家兔多价抗血清与临床泌尿生殖道分泌物标本的结合采用试管凝集法,出现棉絮状沉淀则为阳性;并把同一标本的试管凝集法结果与淋球菌培养结果相比较,观察两者的阳性符合率.同时以生理盐水和非淋菌性尿道炎患者的泌尿生殖道分泌物标本作为对照.结果 成功免疫家兔并获得了PI蛋白多价抗血清,经鉴定多价抗血清的效价达1：8;淋球菌培养阳性的35例分泌物标本中,试管凝集法阳性23例,两方法结果符合率为65.71%.而对照组试管凝集法结果均为阴性.结论 淋球菌外膜PI蛋白不仅具有一定的免疫原性,而且其免疫家兔产生的多价抗血清与淋病患者的分泌物标本有良好的结合率,特异性高.有望经纯化、标记后得到一种新的简单快速的淋病诊断试剂盒.     

淋病奈瑟菌外膜Porin I蛋白多价抗血清的黏附抑制功能

大量资料证实淋病奈瑟菌入侵组织早期首先需黏附至泌尿生殖道上皮细胞表面,然后才能进入机体引起一系列病变。因此黏附是淋球菌致病的先决条件,一旦失去黏附能力,就不能引起淋病^[1,2]。我们在成功地构建、表达并纯化淋球菌外膜GST-PI融合蛋白后(GST:谷胱苷肽S转移酶)^[3],将其免疫家兔制备了PI蛋白的家兔多价抗血清,并观察了该多价抗血清对淋球菌黏附上皮细胞的抑制作用。现报道如下。     

淋病奈瑟菌外膜Porin I蛋白基因的构建、表达和鉴定

目的：构建、克隆淋病奈瑟菌外膜PorinI(PI)蛋白基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法克隆淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因，再与pGEX-4T-2载体连接成表达重组体pGEX-4T-2/PI；经大肠杆菌P2392表达后，用SDS-PAGE、切胶、电洗脱回收等方法纯化GST-PI融合蛋白；然后用特异性淋球菌外膜PI蛋白的单克隆抗体进行斑点免疫层析试验鉴定该蛋白。结果：成功地获取了pGEX-4T-2/PI表达重组体，经诱导表达后能获得高表达的GST-PI融合蛋白，其相对分子质量为60000；斑点免疫层析试验显示其淋病奈瑟菌外膜PI蛋白特异性的。结论：本研究将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜PI蛋白的功能。     

淋球菌主要外膜蛋白的分离纯化及其单克隆抗体的制备

目的 建立快速，敏感，特异的淋球菌感染实验诊断方法。方法 采用溴化己二烯苯基三乙基胺-乙醇沉淀法提取淋球菌外膜蛋白复合物。以Z3.14,EDTA萃取外膜蛋白，经二乙氨基乙酸纤素-SepharoseCL-6B层析纯化获得主要外膜蛋白（PI），并按免疫杂交瘤技术建立分泌抗PI单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株。结果 获得了WI群淋球菌的PIA和WⅡ/WⅢ群淋球菌的PIB，SDS-PAGE测得PIA的分子量为35200，PIB的分子量为36700。建立了可持续，稳定分泌抗PIAMcAb的杂交瘤细胞2株和抗PIBMcAb的杂交瘤细胞3株，5株杂交瘤细胞培养上清液的抗体滴度为1：64-1：256，其诱生的BALB/c小鼠腹水中的抗体滴度为1：4096-1：16384，与淋球菌呈高效价反应。与脑膜炎双球菌等其他抗原不发生反应。结论 获得的高纯度PI及其McAb为建立快速，敏感，特异的淋球菌感染实验诊断方法奠定了基础。     

淋病奈瑟菌外膜PorinⅠ蛋白多价抗血清的黏附抑制功能

大量资料证实淋病奈瑟菌入侵组织早期首先需黏附至泌尿生殖道上皮细胞表面,然后才能进入机体引起一系列病变.因此黏附是淋球菌致病的先决条件,一旦失去黏附能力,就不能引起淋病[1,2].我们在成功地构建、表达并纯化淋球菌外膜GST-PI融合蛋白后(GST:谷胱苷肽S转移酶)[3],将其免疫家兔制备了PI蛋白的家兔多价抗血清,并观察了该多价抗血清对淋球菌黏附上皮细胞的抑制作用.现报道如下.     

淋球菌外膜抗原的免疫原性

淋球菌的唯一宿主是人，在漫长的进化过程中淋球菌形成了一套逃避人体免疫系统的机制。尽管如此，人们却一直试图筛选有保护作用的淋球菌外膜抗原用于疫苗研究，现已发现几个相对稳定的外膜蛋白抗原。     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的原核表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的：克隆、表达沙眼衣原体多形外膜蛋白I（PmpI）基因,并进行免疫原性鉴定,分析其生物学特征。方法用生物信息软件分析沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的基因序列并预测PmpI蛋白的B细胞抗原表位。以D型沙眼衣原体DNA为模板,PCR扩增PmpI基因N端90~1464碱基序列,构建原核载体进行诱导表达。Ni离子亲合层析柱纯化重组蛋白,制备PmpI多克隆抗体并用Western印迹法检测其免疫原性。结果对蛋白质的二级结构和柔性区、氨基酸的亲水性、抗原指数和表面可及性预测结果综合分析,推测该蛋白含有8个优势B细胞表位。PCR扩增D型沙眼衣原体PmpI基因核苷酸序列长度为1375 bp。成功构建pET28a?PmpI原核表达重组体,经诱导表达、亲和层析纯化后获得了相对分子质量为50000的重组蛋白并制备其多克隆抗体。结论成功克隆并表达了D型沙眼衣原体多形外膜蛋白N?PmpI,为研究该蛋白的生物学功能奠定了一定基础。     

淋球菌耐药性的研究进展

淋球菌对常用抗生素有不同的耐药率及耐药机制。对青霉素耐药的主要机制是产生 β-内酰胺酶 ;对四环素耐药的主要机制是细胞膜对药物的通透性降低 ;对大环内酯类、大观霉素耐药的主要机制是作用靶位的改变 ;对氟喹诺酮类耐药的主要机制是 gyrA及parC基因的突变 ;对第三代头孢菌素类敏感性降低或耐药的机制尚未明确 ,但与penB、penA等基因密切相关。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的 克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建原核表达重组载体,并通过E.coli BL21实现MOMP的融合表达.方法 用PCR法扩增MOMP基因,克隆插入到pUCm-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,采用Ni-NTA亲和层析法纯化表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.结果 PCR扩增出约1200bpDNA片段,序列测定证实与基因库登陆的D型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为47000,与预期分子质量相符,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白.结论 沙眼衣原体MOMP基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为沙眼衣原体核酸疫苗的研究奠定了基础.     

淋球菌外膜孔蛋白与环丙沙星耐药关系的初探

淋球菌(NG)的细胞壁结构类似于大肠杆菌(E coli),,由外到内分为3层:外膜、胞间质、内膜。外膜上有大量蛋白质,其中第一类蛋白质(P.I)功能上相当于孔蛋白,主要有3种,相对分子质量分别为31 000、33 000、35 000。环丙沙星(CIP)主要是通过上述3种孔蛋白进入菌体的。当孔蛋白表达下降或不表达时,进入菌体的CIP则减少,细菌对CIP产生耐药性。笔者对5株CIP敏感的NG和3株CIP耐药的NG外膜孔蛋白做了半定量分析,以探讨孔蛋白表达的种类和数量与CIP耐药的关系。     

E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白诱导出的小鼠免疫效应

目的 检验自行研制的E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白(rMOMP)诱导小鼠产生的特异性免疫应答效应.方法 3～4周清洁级BALB/C雌鼠36只,分为佐剂组、单独组和对照组,每组12只.佐剂组采用纯化的rMOMP 50 μg和等体积的弗氏佐剂、单独组单用纯化的rMOMP 50μg、对照组单用PBS200μL,于第0、2、4周分别双侧股四头肌进行免疫.ELISA法检测小鼠血清中沙眼衣原体特异性IgG抗体以及阴道冲洗液中沙眼衣原体特异性sIgA抗体,ELISA法检测细胞因子IFN-γ,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;同源攻击后阴道宫颈脱落细胞沙眼衣原体培养,观察小鼠的迟发型超敏反应以及小鼠的血清抗体中和试验.结果 佐剂组小鼠血清沙眼衣原体特异性IgG抗体A_(405)值为0.641±0.059,淋巴细胞增殖指数5.085±1.291,迟发型超敏反应右足足垫增厚0.324 ±0.054 mm.单独组小鼠血清特异性IgG抗体A_(405)值为0.424±0.015,淋巴细胞增殖指数3.123±0.840,迟发型超敏反应右足足垫增厚0.272±0.064mm.佐剂组各项指标的检测结果都高于单独组(P<0.05)和对照组(P<0.01).结论 沙眼衣原体rMOMP能刺激机体产生有效的特异性体液和细胞免疫.     

淋球菌基因分型方法的研究进展

淋球菌是引起淋病的病原菌,如不及时治疗可以引起严重的并发症。为了更好的研究淋球菌的流行特点、遗传学、免疫学等科学问题,有必要研究淋球菌的分型方法。目前淋球菌分型可分为传统分型和基因分型,其中后者应用较多。在基因分型中,又可分为凝胶电泳DNA条带分型和序列分型。应用除多位点可变数串联重复序列分型以外的凝胶电泳DNA条带分型方法所得到的结果较主观,实验室之间的结果不具有可比性。     

淋病奈瑟球菌表面Porin B蛋白特异性及免疫保护性临床应用价值分析

目的 研究淋病奈瑟球菌(NG)表面Porin B(Por B)蛋白特异性及免疫保护性在临床中的应用价值。方法 登录Gen Bank获取NG世界卫生组织(WHO)标准株E株Por B-PIA基因,设计引物与合成,培养WHO标准株E株,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出Por B-PIA DNA片段,采用GST·Bind^TM树脂纯化Por B蛋白,对噬菌体随机12肽库进行筛选并对阳性克隆进行提取,应用DNA测序及MIXOX软件分析;将培养后的人尿道上皮细胞分别与Por B蛋白特异性结合的多肽、NG活菌进行培养,并将未加入抗体作为对照组。观察Por B蛋白的纯化表达,Western blot检测Por B蛋白与NG特异性关系,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测筛选后蛋白的特异性抗体水平,比较Por B蛋白特异性结合多肽对细胞内形成微菌落的差异。结果 Ecoli-BL21中克隆表达的诱导产物经Ni⁺-NTA Purification System纯化后,获得纯度较高的Por B蛋白;制备出Por B蛋白相应的特异性结合多肽,蛋白出现特异性条带;间接...     

产生过氧化氢的乳酸杆菌对淋球菌生长的影响

目的：为了研究乳酸杆菌对淋球菌生长的影响。方法：将产生和不产生过氧化氢的乳酸杆菌（ＬＢ＋和ＬＢ－）与过氧化氢酶阳性和阴性淋球菌菌株置于适合两种细菌生长的混合培养液在体外混合培养。结果：在混合培养液ｐＨ值维持在７．３时，ＬＢ＋和ＬＢ－几乎对淋球菌的生长无影响，但当混合培养液ｐＨ值５．０时，ＬＢ＋和ＬＢ－均能抑制淋球菌的生长，ＬＢ＋比ＬＢ－的抑制作用更显著，而且对过氧化氢酶阴性比阳性淋球菌的抑制作用更明显。结论：认为ＬＢ＋能通过酸化环境和产生Ｈ２Ｏ２而抑制淋球菌的生长。     

2008年中国淋球菌临床分离株耐药性的流行病学研究

目的 通过对2008年淋球菌耐药监测结果进行分析,了解我国不同地区淋球菌耐药株的流行现状.方法 淋球菌株来自2008年全国淋球菌耐药监测点符合要求的951例淋病患者,其中江苏156例、浙江71例、福建102例、广东207例,广西77例、海南43例、新疆45例、陕西72例、四川80例、重庆44例、天津54例.通过纸片酸度定量法测定β-内酰胺酶,琼脂稀释法测定大观霉素、环丙沙星、头孢曲松钠、四环素对淋球菌的最小抑菌浓度(MIC).结果 大观霉素有2株耐药(0.21%),头孢曲松451株中度敏感(47.42%),质粒介导的高度耐四环素淋球菌(TRNG)487株(51.21%),产青霉素酶淋球菌(PPNG)332株(34.91%),环丙沙星928株耐药(97.58%).淋球菌对多种抗菌药物敏感性间的等级相关分析显示,TRNG阳性率与PPNG阳性率呈正相关(r=0.20,P<0.01),淋球菌对头孢曲松的敏感性与PPNG阳性率负相关r=-0.09,P<0.01),而淋球菌对头孢曲松的敏感性与对环丙沙星的敏感性及TRNG阳性率、淋球菌对环丙沙星的敏感性与PPNG阳性率及TRNG阳性率间没有相关性.卡方分析显示,各省收集的淋球菌对头孢曲松的中敏率之间相差比较大,广西、海南、新疆、陕西四省的中敏率(分别为87.01%、69.77%、82.22%、86.11%)高于总体水平(47.42%);陕西省有2株淋球菌对大观霉素耐药;各省收集的淋球菌对环丙沙星的耐药率较一致(86.11%～100%);广东省收集的淋球菌中TRNG的阳性率(68.60%)明显高于总体水平(51.21%);四川省、浙江省收集的淋球菌中PPNG的阳性率(分别为63.75%和54.93%)明显高于总体水平(34.91%)(P<0.05).结论 不同地区的淋球菌对抗生素的耐药性有明显的差别,其中陕西省收集的淋球菌对首选药物中头孢曲松的中度敏感率及对大观霉素的耐药率较高,应引起重视.

Abstract：

Objective To study the current status of antimicrobial resistance of clinical Neisseria gonorrhoeae isolates in China by analyzing the surveillance results in 2008.Methods N. gonorrhoeae strains were collected from 951 eligible patients at national monitoring sites for resistance of N. gonorrheae,including 156 patients from Jiangsu province,71 from Zhejiang province,102 from Fujian province,207 from Guangdong province,77 from Guangxi province,43 from Hainan province,80 from Sichuan province,44 from Chongqing,45 from Xinjiang Uygur Autonomous Region,72 from Shaanxi province,and 54 from Tianjin.The production of β-lactamase was detected by paper acidometric testing,and minimum inhibitory concentrations(MICs)were determined by agar dilution method for spectinomycin,ciprofloxacin,cefiriaxone,tetracycline,respectively.Results Among the 951 N. gonorrhoeae isolates,2(0.21%)were resistant to spectinomycin,451(47.42%)showed reduced sensitivity to ceflriaxone,928(97.58%)were resistant to ciprofloxacin.Penicillinase-producing N.gonorrhoeae (PPNG) and plasmid mediated tetracycline-resistant N. gonorrhoeae (TRNG) accounted for 34.91%(332/951)and 51.21%(487/951) of these isolates respectively.Kendall rank correlation analysis showed that there was a positive correlation between the positivity rate of TRNG and PPNG(r=0.20,P<0.01),but a negative correlation between the susceptibility to cefiriaxone in N.gonorrhoeae and positivity rate of PPNG(r=-0.09,P<0.01).No correlation was observed between the susceptibility to cefiriaxone and susceptibility to ciprofloxacin or the positivity rate of TRNG,or between the susceptibility to ciprofloxacin and positivity rate of PPNG or TRNG.Chi-square analysis showed a marked increase in the percentage of N.gonorrhoeae isolates with reduced susceptibility to ceftriaxone in Guangxi province,Hainan province,Xinjiang Uygur Autonomous Region and Shaanxi province,the percentage of N.gonorrhoeae isolates with resisitance to spectinomycin in Shaanxi province,prevelance of TRNG in Guangdong province,and prevelance of PPNG in Sichuan and Zhejiang provinces compared with the average level (all P<0.05).Conclusions Thero is a significant diffefence in antimicrobial susceptibility of N.gonorrhoeae from difierent areas of China.A significant elevation is observed in the percentage of N.gonorrhoeae with reduced susceptibihty to cefifiaxone and resistance to spectinomycin in Shaanxi province.to which close attention should be paid.     

淋球菌染色体mtrR基因突变对淋球菌多重耐药性的影响

目的 对淋球菌的染色体耐药机理进行了一定的探索。方法 聚合酶链反应及Sanger双脱氧链终止法,测定淋球菌mtrR基因的碱基序列,并做相应淋球菌的药敏试验。结果 具有青霉素耐药性的淋球菌毫无例外都有mtrR基因的单碱基突变,而耐壮观霉素的淋球菌在mtrR基因上有两个位点突变。结论 淋球菌染色体上mtrR基因的突变会引起淋球菌多重耐药性的产生,增加淋球菌对脂溶性细胞毒因子如脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸的抗性。     

淋球菌对头孢三嗪的敏感性测定

目的：了解淋球菌对头孢三嗪的敏感性。方法：我们对１９８９年～１９９６年间由１０个城市淋病患者中分离出的１３２９株淋球菌临床分离株进行了头孢三嗪敏感性测定。以琼脂稀释法测定头孢三嗪的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）。结果：头孢三嗪ＭＩＣ范围为０．００２～２ｍｇ／Ｌ。ＭＩＣ５０为０．０３ｍｇ／Ｌ，ＭＩＣ９０为０．１２５ｍｇ／Ｌ。６１．４７％的菌株对头孢三嗪敏感（ＭＩＣ≤０．０３ｍｇ／Ｌ），３７．４７％为低敏ＭＩＣ，ＭＩＣ达１ｍｇ／Ｌ的耐药菌株占１．０５％。自１９９５年起未分离出耐药菌株。结论：研究表明我国目前流行的淋球菌菌株基本上对头孢三嗪敏感。     

广东省5市525株淋球菌临床分离株耐药性的流行病学研究

目的:对2011²012年广东省广州、佛山、江门、肇庆和珠海等五市临床分离的525株淋球菌流行株对青霉素、四环素、环丙沙星、头孢克肟、头孢曲松和大观霉素等6种抗生素的敏感性监测结果进行分析,了解我省不同地区淋球菌耐药株的流行现状。方法:采用琼脂稀释法测定菌株对6种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),敏感性判断按WHO西太区淋球菌耐药性监测统一标准,其中头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)标准判断。用纸片酸度法检测产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)菌株。结果:来自五地525株淋球菌中检出430株对青霉素耐药(81.9%),四环素和环丙沙星耐药株(率)分别为484株(92.2%)和514株(97.9%),未发现对大观霉素、头孢克肟和头孢曲松耐药菌株,但头孢曲松中敏有178株(33.9%),头孢克肟中敏只有7株(1.3%)。青霉素、四环素和环丙沙星的MIC50及MIC90均已超过耐药标准。检出PPNG株189株(36.0%),四环素高度耐药淋球菌(TRNG)248株(47.2%)。2分析显示,肇庆市淋球菌流行株对青霉素的耐药率高于总体水平(2=13.88,P<0.01);广州市四环素耐药率最高(2=10.58,P<0.01);五地市淋球菌对环丙沙星的耐药率较一致(94.1%2012年广东省广州、佛山、江门、肇庆和珠海等五市临床分离的525株淋球菌流行株对青霉素、四环素、环丙沙星、头孢克肟、头孢曲松和大观霉素等6种抗生素的敏感性监测结果进行分析,了解我省不同地区淋球菌耐药株的流行现状。方法:采用琼脂稀释法测定菌株对6种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),敏感性判断按WHO西太区淋球菌耐药性监测统一标准,其中头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)标准判断。用纸片酸度法检测产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)菌株。结果:来自五地525株淋球菌中检出430株对青霉素耐药(81.9%),四环素和环丙沙星耐药株(率)分别为484株(92.2%)和514株(97.9%),未发现对大观霉素、头孢克肟和头孢曲松耐药菌株,但头孢曲松中敏有178株(33.9%),头孢克肟中敏只有7株(1.3%)。青霉素、四环素和环丙沙星的MIC50及MIC90均已超过耐药标准。检出PPNG株189株(36.0%),四环素高度耐药淋球菌(TRNG)248株(47.2%)。2分析显示,肇庆市淋球菌流行株对青霉素的耐药率高于总体水平(2=13.88,P<0.01);广州市四环素耐药率最高(2=10.58,P<0.01);五地市淋球菌对环丙沙星的耐药率较一致(94.1%¹00%);头孢曲松的中敏率之间相差较大(2=19.60,P<0.01),广州收集的淋球菌对头孢曲松的中敏率高于总体中敏率(2=6.96,P<0.01);5地市PPNG流行率有明显差异(2=15.67,P<0.01),其中肇庆PPNG流行率高于总体水平(2=6.31,P<0.05);5地市TRNG流行率无统计学差异(2=4.16,P>0.05)。结论:不同地区的淋球菌流行株对抗菌药物的耐药性有明显差别,广州市收集的淋球菌流行株对头孢曲松中敏率较高,肇庆市收集的淋球菌流行株中PPNG流行率较高。     

淋球菌流行株对阿奇霉素等7种抗菌药物敏感性的检测

目的:检测2013年度本地区临床分离的淋球菌流行株对青霉素、四环素、大观霉素、头孢曲松、环丙沙星、头孢克肟和阿奇霉素等7种抗菌药物的敏感性,分析耐药菌株的流行特点。方法:采用琼脂稀释法测定85株菌株对7种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),判断敏感性按WHO西太平洋区淋球菌耐药性监测统一标准。用纸片酸度法检测产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)菌株。结果:85株淋球菌中检出68株对青霉素耐药(80%),产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)32株(37.6%);四环素耐药率为84.7%,其中质粒介导高度耐四环素淋球菌(TRNG)34株,占40%;环丙沙星和阿奇霉素的耐药率分别为97.6%和3.5%。未发现对头孢曲松、头孢克肟、大观霉素耐药菌株,但头孢曲松和头孢克肟敏感性降低的菌株分别为16.5%和5.9%。青霉素、四环素和环丙沙星的MIC50及MIC90均已超过耐药标准,青霉素和四环素MIC50及MIC90均大于耐药标准的32倍。结论:淋球菌对青霉素、四环素和环丙沙星耐药率较高,对大观霉素、头孢曲松和头孢克肟的敏感性较高,出现阿奇霉素的耐药株。