大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经细胞在体外 对C6胶质瘤细胞的趋向性

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞的趋向性。方法首先采用梯度离心分离BMSCs,在条件培养基中添加合适诱导因子诱导BMSCs分化为神经细胞,分化后的细胞进行免疫荧光细胞化学分析后与C6胶质瘤细胞采用Transwell培养板共培养,最后对迁移的细胞做统计学分析。结果 BMSC成功诱导分化为神经细胞Nestin(24.3±5.2)%、NSE(33.6±3.8)%和NeuN(41.9±4.7)%,共培养实验显示实验组迁移细胞明显多于对照组迁移细胞(p<0.05)。结论大鼠骨髓间充质干细胞分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞具有明显趋向性。     

骨髓间充质干细胞干预大鼠C6胶质瘤的试验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)干预对大鼠脑胶质瘤C6细胞分化的影响及其相关机制.方法 采用Transwell小室共培养骨髓间充质干细胞及C6细胞,并以细胞计数法对C6细胞增值水平进行检测,以流式细胞术对C6细胞的细胞周期进行检测;以免疫荧光对波形蛋白(vimentin)的表达情况进行检测,以免疫组化法对胶质纤...     

鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况。 方法：取肝素抗凝人骨髓血，Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞，胰酶消化后传代扩增。取第4~6代骨髓间充质干细胞，当细胞达90%融合时，按2×103/孔接种于24孔板内，第2天分为两组，诱导组用含有50% C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基（含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基）诱导，每隔2 d换液1次；对照组单纯加入完全培养基进行培养。诱导后3 d，两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色，检测神经元特异性标志物的表达。 结果：诱导24 h后，诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观，对照组细胞形态无明显变化。诱导3 d后，诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组（P < 0.01）；诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为（44.2±2.4）%，对照组为阴性；两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达。 结论：鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性。方法阿尔法最低必需培养基(α-MEM)、神经细胞生长添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导BMSCs向神经细胞分化。体外通过Transwell系统共培养BMSCs源性神经细胞与C6胶质瘤细胞培养基,HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量;体内在C6胶质瘤模型中移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs源性神经细胞,免疫组化分析移植细胞的迁移能力。结果条件培养基诱导BMSCs分化的细胞表达神经元核抗原(NeuN)为47%±0.08%,高分子量神经丝蛋白(NF-H)为45%±0.07%及部分巢蛋白(Nestin)为10%±0.04%,体外Transwell结果显示BMSCs源性神经细胞透过聚碳酸酯膜微孔的数量明显高于对照组(P<0.05),体内移植结果显示BMSCs源性神经细胞与BMSCs对胶质瘤的迁移无明显差异(P>0.05)并呈现时间特异性(P<0.01)。结论 BMSCs源性神经细胞对C6胶质瘤有明显的趋向性。     

骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤趋向性的初步研究

背景骨髓间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓中的非造血类干细胞,具有自我更新及多向分化潜能.在大鼠脑外伤模型中的迁移能力已得到证实,而其对于脑胶质瘤的趋向性的研究尚处于初期.本实验通过将标记的MSCs移植到大鼠脑胶质瘤模型体内,观察它的迁移情况.方法采用全骨髓细胞培养法,利用MSCs的贴壁生长及可在体外长期培养的特性,获取纯化的MSCs.采用流式细胞术鉴定其表面抗原及细胞周期.在处于对数生长期的MSCs培养皿中加入BrdUrd(终浓度10μg/mL),培养24～48 h后进行移植.采用立体定向技术建立大鼠脑胶质瘤模型,3 d后移植标记好的MSCs在大脑半球组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤对侧大脑;在颈内动脉组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤同侧的颈内动脉.分别以BrdUrd标记的3T3细胞作为对照组.2周后,处死大鼠取脑组织制作病理切片,进行抗BrdUrd免疫组化及免疫荧光染色,观察MSCs的迁移情况.结果全骨髓培养法获得了纯化的MSCs.移植到脑组织及颈内动脉的BrdUrd标记的MSCs表现出了明显的向脑胶质瘤迁移的特性.在大脑半球组,MSCs主要集中在肿瘤与正常脑组织的交界部位,在瘤内只有少量分布.在颈内动脉组,MSCs主要分布于肿瘤内部,在肿瘤与正常脑组织的交界位置有少量分布.结论MSCs具有明显的向脑胶质瘤迁移的特性,同时亦可通过血脑屏障,有可能成为胶质瘤基因治疗的理想载体.     

骨髓间充质干细胞在胶质瘤基因治疗中的应用

胶质瘤因其固有的侵袭生长特性,使现阶段临床所实施的各项治疗措施总难以彻底清除浸润于实质深部或远离肿瘤床部位的散在瘤细胞,而这些散在细胞也成为胶质瘤术后复发、病死率居高不下的主要原因。随着胶质瘤基因治疗的展开,现已发现包括自杀基因、反义基因、野生基因替代等多种行之有效的基因治疗靶的和治疗策略。但回顾多年来基因治疗所选择的转基因载体(包括病毒载体与非病毒载体),因其在目的基因转染率、表达率及恒定表达和免疫源性等方面各自存在的不足,很难     

人羊膜间充质干细胞移植对荷瘤鼠C6胶质瘤生长的抑制

背景：实验室前期课题成果显示，脐血或羊膜间充质干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察，于2008-06/09在郑州大学微生物与免疫教研室完成。 材料：胎盘来源于郑州大学一附院妇产科健康剖宫产产妇，C6胶质瘤细胞株由北京神经外科研究所惠赠，10只BALR/c裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。 方法：无菌条件下取胎盘，分离部分羊膜，体外分离培养人羊膜间充质干细胞，传至第3代用于实验。10只裸鼠背部双侧皮下注射含3×106个C6胶质瘤细胞的DMEM/F12培养基，建立双侧荷瘤鼠模型。成功造模后，模型对照组于裸鼠左侧皮下注射DMEM/F12培养基50μL，细胞移植组于同一裸鼠右侧皮下注射含2×106个羊膜间充质干细胞的等量DMEM/F12培养基。 主要观察指标：肿瘤生长情况，周围组织浸润及新生血管形成等病理学观察，免疫组化法检测肿瘤中细胞周期素D1的表达。 结果：细胞移植后14，21 d，细胞移植组肿块体积明显小于模型对照组（F=54.127，P < 0.05）。模型对照组瘤体呈结节状，部分肿瘤组织中心有坏死现象，内部有新生血管形成，肌层及皮肤浸润较明显，已达腹膜；细胞移植组瘤体分叶较少，无新生血管形成，仅有局部的皮肤浸润，未见肌层浸润。模型对照组细胞周期素D1蛋白呈阳性表达，而细胞移植组表达阳性率较低。 结论：人羊膜间充质干细胞可明显抑制荷瘤鼠C6胶质瘤细胞的生长，同时可抑制细胞周期素D1蛋白的异常表达。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%)。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。 目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。 方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。 结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109 pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(adult rat marrow mesenchymal stem cells,rMSCs)的体外增殖和特异性诱导分化为神经元样细胞的能力.方法 分别采用3种不同的诱导方法体外定向诱导第三至五代的rMSCs向神经元样细胞分化,并分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和免疫细胞组化检测神经元样细胞所表达的神经元特异性标志[神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和神经丝蛋白(neurofilament,NF)]及星形胶质细胞特异性标志[胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP)],并进行神经元样细胞定量分析.结果 所采用的3种定向诱导方法都能使rMSCs特异性诱导分化为神经元样细胞,此神经元样细胞都能特异性地表达出NSE和NF,而不表达GFAP.经过定量计数分析发现用上述方法处理rMSCs 后出现NSE阳性的细胞约为75.5%±3.5%,出现NF阳性的细胞约为77.2%±2.8%.结论 rMSCs能在体外扩增、传代,并能被定向诱导分化为神经元样细胞.     

大鼠骨髓基质干细胞治疗C6胶质瘤实验研究

目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)在体内环境下对C6胶质瘤的治疗效果。方法流式细胞术检测培养的BMSCs表面标记;SD大鼠生存周期绘成Kaplan-Meier图,行Log-rank Test,HE染色和BrdU免疫组化染色观察BMSCs对胶质瘤的趋向性和治疗情况。结果流式实验显示所培养细胞为BMSCs;HE染色结果示呈瘤率为100%,实验组较对照组生存时间明显延长;BrdU免疫组化染色示BMSCs存在于肿瘤组织及其周边。结论侧脑室移植BMSCs后,BMSCs可向肿瘤组织迁移,并可改善荷瘤大鼠的生存质量,明显延长其晚期生存周期。     

VP_(22)修饰的CD基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6脑胶质瘤体外实验研究

目的 探讨病毒蛋白VP_(22)在胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6胶质瘤中的作用.方法 质粒pAdTrack-CMV-CD中PCR获取CD片段,克隆到慢病毒(lentivirus)质粒pHIV-EGFP和pHIV-VP_(22)-EGFP载体上,获得重组质粒pHIV-CD-EGFP和pHIV-VP_(22)-CD-EGFP,采用酶切和PCR技术进行鉴定.病毒包装采用三质粒系统共同转染293T细胞.CD基因的表达采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法鉴定.Lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP四种慢病毒感染经体外原代培养、扩增的SD大鼠胎脑神经干细胞(Nerual stem cells,NSCs),体外与C6细胞按1:1比例共培养,并加入终浓度100 mg/L的5-氟胞嘧啶(5-FC)培养3 d后,MTT比色法测定细胞存活率.结果 酶切和PCR证实,重组的慢病毒中含有CD基因.慢病毒lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP分别感染NSCs后与C6细胞共培养,在5-FC作用下,其细胞存活率分别为(95.57±4.83)%,(49.96±7.19)%,(94.25±4.32)%和(28.06±6.26)%.统计学处理,转染lentivirus-CD-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP组的细胞存活率明显低于其相应对照组lentivirus-EGFP和lentivirus-VP_(22)-EGFP(P<0.01);其中转染lentivirus-VP_(22)-EGFP组的细胞存活率又明显低于lentivirus-EGFP组(P<0.01).结论 VP_(22)能够在体外增强CD基因修饰的NSCs抗C6胶质瘤疗效.     

2-甲氧基雌二醇对C6脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用

目的 探讨2-甲氧基雌二醇对C6脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 以不同浓度的2-甲氧基雌二醇分别作用C6胶质瘤细胞不同时间,采用甲基噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,并用光镜及电镜观察细胞形态学变化。结果 经2-甲氧基雌二醇作用后,C6胶质瘤细胞活性受抑制,且呈时间依赖性,作用组与对照组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。此外,2-甲氧基雌二醇还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在作用组与对照组之间存在显著差异（P〈0.05）;细胞周期检测发现作用组G1及S期细胞减少,G2期细胞增多,与对照组存在显著差异（P〈0.05）。结论 2-甲氧基雌二醇可抑制C6胶质瘤细胞生长,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

C6大鼠胶质瘤模型及其在脑胶质瘤治疗研究中应用的缺陷

C6细胞是大鼠经化学致癌剂N-亚硝基甲脲体内诱发产生的脑胶质瘤细胞。具有较典型的人脑胶质瘤组织学特点。大鼠脑内立体定向接种C6细胞建立的动物模型。因成瘤高，动物手术死亡率低。所以广泛应用于脑胶质瘤治疗的研究中。国外研究发现，来源于非纯种大鼠的C6细胞具有有强的免疫原性；其主要组织相容性基因复合体中存在与大鼠是异源性的基因；C6细胞接种于大鼠体内引发强烈的免疫排斥反应可使肿瘤不能持续生长甚至自行消退，因此混淆了治疗所产生的效应。尤其当用于免疫和基因免疫治疗的研究时，存在较大缺陷。     

Δ-Tetrahydrocannabinol stimulates glucose utilization in C6 glioma cells

The present work was undertaken to study the metabolic response of C6 glioma cells to physiologically relevant doses of Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC), the major active component of marijuana. At those concentrations (i.e. nanomolar range), THC produced a dose-dependent increase in the rates of glucose oxidation to CO₂ and glucose incorporation into phospholipids and glycogen. The THC-induced stimulation of glucose utilization was (i) dose-dependent up to 100 nM THC, (ii) mimicked by the synthetic cannabinoid HU-210, and (iii) prevented by pertussis toxin and the CB1 receptor antagonist SR141716A. In contrast to THC, forskolin markedly depressed CO₂ production, phospholipid synthesis and glycogen synthesis from glucose. The forskolin-induced inhibition of glucose utilization was (i) mimicked by dibutyryl-cAMP, and (ii) prevented by THC, HU-210 and H-7, an inhibitor of the cAMP-dependent protein kinase. Likewise, THC was able to antagonize in part the forskolin-induced elevation of intracellular cAMP concentration, and this antagonistic effect was prevented by SR141716A. However, THC per se did not affect basal cAMP concentration. Results thus indicate that physiologically relevant doses of THC stimulate glucose metabolism in C6 glioma cells through a cannabinoid receptor-mediated process. Although cannabinoid receptors may be coupled to inhibition of adenylyl cyclase in C6 glioma cells, this does not seem to be the mechanism involved in the THC-induced stimulation of glucose metabolism.     

血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对体外培养的C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度塞来昔布分别作用于C6胶质瘤细胞不同时间段,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并用光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化。结果经不同浓度塞来昔布作用后,C6胶质瘤细胞活性受到抑制,且呈剂量时间依赖性,实验组与对照组之间以及实验组各亚组之间均有显著性差异（P〈0.05）。细胞周期检测发现实验组S期细胞减少,G2期细胞显著增加,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;同时,塞来昔布还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在实验组与对照组之间有显著性差异（P〈0.05）。结论选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可抑制C6胶质瘤细胞增殖,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

三氧化二砷诱导C6胶质瘤细胞凋亡实验研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）在体外是否具有抗鼠胶质瘤作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法：应用不同浓度As2O3,且在不同时间点分别处理C6胶质瘤细胞株及原代培养的正常鼠神经胶质细胞,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法,观察As2O3对C6胶质瘤细胞株及正常鼠神经胶质细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双重荧光染色检测两种细胞凋亡的形态变化,并用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin-V和PI双标记法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：MTT法发现,As2O30.5～8.0μmol/L的浓度均可显著抑制C6胶质瘤细胞株的生长,而对正常原代神经胶质细胞株的抑制作用较弱。经As2O3作用后,透射电镜、Hoechst33342/PI双染荧光均观察到C6胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变;运用Annexin-V-FITC/PI双标记法在流式细胞仪检测显示,随As2O3浓度的增大和时间的延长,C6胶质瘤细胞株的凋亡率明显上升,而正常神经胶质细胞的凋亡率要明显小于C6胶质瘤细胞株。结论：As2O3在体外可显著抑制C6胶质瘤细胞株生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且凋亡率随As2O3作用的时间和剂量的增加而增加。但As2O3对正常神经胶质细胞生长的抑制作用较弱,提示As2O3抑制细胞生长的作用具有一定的选择性。