呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性.方法 PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALA/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL).结果 构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(＞90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性.结论 建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.     

免疫磁珠分离技术纯化和检测泰泽氏病原体的研究

目的建立泰泽氏病原体(Ty)纯化方法,获得纯的菌体供抗原研究,为ELISA诊断抗原的制备提供依据;并尝试建立Ty隐性感染血清学抗原检查方法。方法选择特异性抗体包被磁珠,从感染大鼠肝脏中富集和纯化Ty;用SDS-PAGE和Western blot技术考察纯化Ty的蛋白和抗原图谱;同时用免疫磁珠分离技术(IMS)直接检查隐性感染大鼠肠道上皮细胞内的Ty。结果用辛酸-硫酸铵纯化的Ty单克隆抗体M5以0·5μg/107beads以上浓度包被抗IgG抗体预结合的磁珠4h,可最大效率地富集Ty;分离反应进行1h,敏感性达到103菌体/mL;吖啶黄染色镜检法可以直接、快速地观察到结合于磁珠上的细菌;抗原分析表明,IMS较好地去除了肝组织和真核细胞成分,纯化的Ty RJ株具有3个免疫优势的抗原成分,相对分子质量(Mr)分别为160×103、116×103、55×103;此外,IMS法可直接从隐性感染大鼠盲肠上皮细胞中检测到少量寄生的Ty。结论用IMS技术可有效地富集和纯化Ty,并可以作为Ty隐性感染血清学抗原检查的候选方法。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.     

免疫磁珠法分选小鼠肝脏Kupffer细胞及其特性观察

目的:建立免疫磁珠法,分离纯化小鼠肝脏Kupffer细胞并进行功能鉴定。方法:采用原位肝脏酶灌注、制备肝非实质细胞悬液、加入PE标记的大鼠抗小鼠F4/80一抗,然后结合山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠分选Kupffer细胞,流式细胞仪检测其纯度并检测其吞噬功能。结果:在经过胶原酶Ⅳ型消化、免疫磁分选,获得小鼠肝Kupffer细胞产量约为(8.05±0.34)×106/鼠肝,细胞纯度为(96.6±0.7)%,细胞活力大于90%。结论:应用免疫磁珠法能有效地分离纯化小鼠肝脏Kupffer细胞,为体外进一步研究提供了高纯度和活力的Kupffer细胞群。     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34+造血干细胞

目的探讨免疫磁珠法(MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34+造血干细胞.方法应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34+细胞,流式细胞仪(FACS)评估纯化效率,检测纯化后的细胞活力.结果纯化后CD34+细胞纯度81.5%(范围76.80%～85.38%),回收率47.54%(范围40.50%～54.31%),纯化前后细胞活力不受影响(P=0.169).结论应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34+细胞,并不影响细胞活力.     

人卵巢癌微血管内皮细胞的培养及体外管腔样结构形成的观察

目的建立人卵巢癌微血管内皮细胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells,ODMECs)免疫磁珠分选体系并观察ODMECs体外二维管腔样结构(tubule-like structure,TLS)的形成。方法利用结合有CD31抗体的MACS MicroBeads免疫磁珠分选系统分离纯化ODMECs。通过形态学、生化和表型特征对所获得的ODMECs进行鉴定;并检测其摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated-low-density lipoprotein,DIL-acLDL)和结合凝集素Ⅰ(UEA-Ⅰ)的能力,观察其在体外培养体系中二维管腔样结构的形成。结果所获ODMECs流式分析细胞纯度可达99.6%,具有卵石征、接触抑制,表达CD31、CD105、FⅧ-Rag;具有结合UEA-Ⅰ和摄取DIL-acLDL的能力;培养过程中观测到ODMECs可形成二维管腔样结构。结论成功建立了人ODMECs的免疫磁珠分离培养方法,并观察到ODMECs具有体外二维管腔样结构。     

免疫磁珠及尼龙毛分离纯化T淋巴细胞的比较研究

目的:探讨免疫磁珠及尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法及其特点.方法:用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,再分别以尼龙毛和免疫磁珠分离出T细胞,然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖性能.结果:免疫磁珠方法分离后T细胞的纯度显著高于尼龙毛分离方法(P＜0.05),而且回收率也大于尼龙毛分离方法(P＜0.001),但二种方法分离的T细胞在细胞活力和增殖性能方面比较差异无显著性(P＞0.05).结论:在细胞生物学研究中,免疫磁珠分离法是有效分纯T细胞的较佳方法.     

呼吸道合胞病毒感染诱导人支气管上皮细胞表达胸腺基质淋巴生成素的信号转导机制探讨

目的 探讨哮喘发病过程中呼吸道合胞病毒(RSV)感染通过诱导支气管上皮细胞表达胸腺基质淋巴生成素(TSLP)来加重哮喘症状的具体信号转导机制.方法 构建RSV病毒F蛋白真核表达载体pcDNA3-F,转染体外培养的人气管上皮细胞株CRL-9483,同时转染Smad7表达载体pcDNA3/Smad7或者添加p38、ERK1/2、JNK、JAK/STAT通路选择性阻断剂,24 h后利用RT-PCR观察各组细胞中TSLP mRNA量的改变情况,观察哪些抑制剂可以下调TSLP mRNA水平.对TSLP显著下调的实验组扩大细胞培养规模,提取细胞浆蛋白后,利用Western Blotting在TSLP蛋白水平进行观察.结果 体外培养的CRL-9483细胞在转染空载体pcDNA3情况下基本不表达TSLP蛋白(TSLP/GAPDH PCR产物相对灰度0.10±0.03),F蛋白的转染可以明显促进其mRNA水平的增高(0.42±0.20,P=0.024),这种增高可以部分被p38抑制剂(0.14±0.04)和JNK抑制剂(0.23±0.07)所阻断,与F蛋白转染组相比P值分别为0.036和0.048,而Smad7阻断剂(0.60±0.25)、ERK1/2抑制剂(0.45±0.23)以及JAK/STAT1阻断剂(0.44±0.25)无此阻断作用,与单纯F蛋白转染组相比P＞0.05.利用Western Blotting分析发现与单独RSV病毒F蛋白表达组(TSLP/GAPDH蛋白条带相对灰度8.13±2.20)相比,p38抑制剂(3.67±1.18)和JNK抑制剂(1.48±0.77)也可以导致TSLP蛋白水平的下降.结论 RSV感染可以通过其F蛋白来刺激气道上皮细胞表达TSLP,p38和JNK信号通路参与到该过程中,这可能是RSV感染诱导或加重哮喘气道炎症的一个重要原因.     

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其病毒蛋白特异性的识别

应用呼吸道合胞病毒(RSV)武汉地方株滴鼻加用病毒感染的Hela细胞免疫Balb/C鼠,取脾细胞与来自实体瘤的SP2/0细胞融合,培育出分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株8株其中3株有中和病毒作用。应用RSV感染Hela细胞作为RSV抗原建立了RSV的免疫转印方法,并应用免疫转印对各单抗的病毒蛋白特异性进行了初步识别:发现1株单抗识别RSV M蛋白,1株识别22 K蛋白,2株识别G蛋白,另外4株单抗的蛋白特异性尚待进一步研究确定。     

免疫磁珠法分离preS1结合蛋白

目的:用免疫磁珠分离人肝癌细胞(HepG2)细胞膜上与乙型肝炎病毒(HBV)preS1肽段结合的蛋白,建立快速分离膜受体蛋白的方法。方法:提取HepG2细胞膜蛋白,以生物素标记的preS1肽段为钓饵,与提取的膜蛋白4℃孵育过夜,加入链霉亲和素标记的磁珠,洗涤磁珠后收集结合蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离结合蛋白。结果:用磁珠的方法所收集到的结合蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离出了多条条带,比较明显的45～97 ku有9条,>97 ku处有5条,<20 ku处有2条。结论:通过免疫磁珠分离法可有效的获得HepG2细胞膜上preS1肽段的结合蛋白。     

免疫磁珠法分离纯化人肾癌CD133~+细胞实验研究

目的:本研究通过分析CD133+细胞在肾细胞癌患者肿瘤组织的表达情况,寻找肾癌中CD133+细胞分离纯化方法,探寻CD133+细胞与肾癌发生中的作用。方法:①应用胎盼蓝拒染试验检测细胞活性。②应用免疫磁珠法分离纯化肿瘤组织中CD133+细胞。③应用流式细胞仪检测肾透明细胞癌标本中CD133+细胞表达情况。结果:30例肾透明细胞癌中CD133+比为(13.08±1.39)%,与病理分级、临床分期无关。免疫磁珠法分离纯化CD133+纯度为(75±2.4)%,细胞活性不受影响。结论:免疫磁珠技术纯化肾癌CD133+细胞成熟有效,CD133+细胞可能是肾癌干细胞。     

肝脏特异性F抗原的提纯与鉴定

目的:建立一种新的分离纯化人肝脏特异性F抗原(肝脏F蛋白)的方法,为临床检测肝脏特异性F抗原提供物质基础.方法:在0.25 mol/L蔗糖中,人肝组织匀浆以105000 g离心后,上清液用Sepharose 6-B和DEAE-ED52两步柱层析分离,最后经等电聚焦,得到纯化的F抗原.用纯化的F抗原免疫兔子获相应的多克隆抗体.结果:纯化的肝脏F抗原经SDS-PAGE电泳鉴定呈单一区带,分子量约44000 Da,PI在6.5-6.7之间,密度为1.26,是一种蛋白质抗原,不含有可探测到的碳水化合物和脂类.结论:经两步柱层析及等电聚焦可获得纯化的F抗原,并保留了免疫特性,可供进一步研究其临床价值.     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因序列分析

目的分析中国北京地区4株呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的基因序列并与RSV原型株A2进行比较,得出中国北京地区RSV F蛋白基因是否存在变异及变异特征。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分2段扩增F蛋白的基因核苷酸序列,将得到的P1、P22段切胶纯化标记后测序,应用Bioedit软件对得到的序列做碱基配对和比较分析。结果4株RSV F蛋白核苷酸序列的同源性为94.92%~95.62%。信号肽区的同源性为99.36%~99.73%。F1、F2亚单位同源性分别为98.93%~99.31%和96.69%~97.33%。氨基酸同源性分别为:F蛋白的蛋白编码区97.39%~97.74%,信号肽区99.13%~99.65%,F1、F2亚单位98.78%~99.48%、98.61%~99.30%。结论中国RSV北京株与原型株A2之间的F蛋白基因变异小,具有很高的同源性。氨基酸在抗原位点Ⅱ保守,此段氨基酸可作为RSV疫苗的候选位点。     

新生小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离方法

目的提取新生小鼠的原代肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ),并进行培养和鉴定。方法应用酶消化和免疫磁珠分选方法分离并纯化C57B/L6新生小鼠AECⅡ。根据AECⅡ特异的细胞形态,利用透射电镜进行鉴定。正置荧光显微镜观察AECⅡ特异性肺泡表面活性蛋白-C前体(proSP-C)及表面活性蛋白-B (SP-B)的表达。免疫印记技术检测新生小鼠AECⅡ中特异性肺泡表面活性蛋白-A (SP-A)及proSP-C的表达。结果每只新生小鼠可获得(2±0.5)×105AECⅡ,纯度>90%。电镜下可见丰富的AECⅡ及其特异结构板层小体。正置免疫荧光显微镜观测AECⅡ中proSP-C和SP-B蛋白的表达,免疫印迹结果显示细胞内SP-A和proSP-C蛋白表达呈阳性。结论利用酶消化和免疫磁珠分选的方法可成功分离出高产量、高纯度的新生小鼠AECⅡ。     

免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞及初步鉴定

目的:应用免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞,观察其分选效果,建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(hMAPCs)的方法.方法:取健康成人志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,在自制培养基下贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,锥虫蓝拒染实验计数MACS分选前后细胞活力.流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度;流式细胞仪分析培养细胞CD29、CD44、CD34和HLA-DR表达情况.结果:通过MACS分选,平均每1×106/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×104/ml hMAPCs,分选后的hMAPCs细胞生长良好,最长传代到第20代.分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;流式细胞仪分析获取的CD45-、GlyA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪检测hMAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99.2%,CD44阳性细胞比率为98.3%,CD34阳性细胞比率为1.2%,HLA-DR阳性细胞比率为5.3%.结论:CD45、GlyA免疫微磁珠负分选可从骨髓中分离高纯度的hMAPCs;分选后hMAPCs在自行研制的培养基中有较强的增殖能力.     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内的蛋白互作

目的 通过BioID-质谱联用建立一种新的蛋白相互作用的筛选系统;通过免疫共沉淀-Western blot验证YAP1相互作用的蛋白。 方法 构建BirA*-YAP1融合表达质粒;将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养液中加入生物素,继续培养24小时后,提取细胞总蛋白。利用YAP1特异抗体,通过Western Blot检测BirA*-YAP1融合蛋白的表达;通过HRP-亲和素,检测细胞内蛋白被生物素标记的水平;通过亲和素磁珠,对细胞内生物素化的蛋白进行亲和纯化,并多次洗涤亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白后,对亲和素磁珠纯化的蛋白进行溶解。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,通过蛋白银染试剂盒对PAGE凝胶中的蛋白进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果。通过Label-free质谱法对生物素化的蛋白进行鉴定。针对鉴定得到的蛋白,通过Western Blot对生物素化的SMAD3进行验证。通过YAP1的免疫共沉淀,确定SMAD3能与YAP1相互作用。 结果 成功构建BirA*-YAP1融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白;在生物素存在的情况下,BirA*-YAP1融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与BirA*-YAP1融合蛋白相互靠近的蛋白。在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白,能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白。通过质谱鉴定,我们能够获得在细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白类型。通过免疫共沉淀-Western Blot技术,我们证明SMAD3能够与YAP1相互作用。 结论 Bio-ID-质谱联用的方法是一种用于蛋白互作筛选的简单、高效的技术,与后续的免疫共沉淀-Western Blot联合使用,可以成为一种新的蛋白互作研究体系。     

免疫磁珠法分离骨髓CD34~+细胞的方法研究

目的 探讨免疫磁珠法分离CD34 细胞的方法. 方法 应用密度梯度离心法分离骨髓单一核细胞,后采用免疫磁珠法从单一核细胞中分选出CD34 细胞,流式细胞仪鉴定其纯度. 结果 各样品分离出的CD34 细胞占骨髓单一核细胞含量的(2.19±0.12)%,经流式细胞仪鉴定应用免疫磁珠分离的CD34 细胞纯度为(94.6±2.1)%. 结论 免疫磁珠法是分离CD34 细胞较理想的方法.     

四川呼吸道合胞病毒F蛋白基因序列和抗原表位变异分析

目的 分析呼吸道合胞病毒(RSV)四川分离株F蛋白基因序列,探讨F蛋白基因和抗原表位变异情况.方法 RT-PCR方法扩增F蛋白近全长序列并测序,分析核苷酸和氨基酸变异位点,比较不同亚型和基因型间中和表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位基因组成.结果 10株RSV F蛋白的核苷酸和氨基酸P-distance分别为0.102±0.005和0.058±0.006,中和表位47F和L4在亚型间高度保守,而RS-348和7C2在亚型内保守,CTL表位HLA B*57、HLA A*01和HLA Cw* 12也是亚型内高度保守,亚型间存在个别氨基酸变异.结论 RSV四川分离株F蛋白基因保守度较高,抗原表位在亚型内保守,已在A亚型上识别的CTL表位可能在B亚型内不能识别.     

金欣口服液阻断呼吸道合胞病毒入侵的实验研究

目的 研究金欣口服液含药血清时呼吸道合胞病毒入侵宿主细胞环节的影响.方法 在病毒和细胞接触期间采用转换温度方法观察金欣口服液含药血清对 RSV 黏附、侵入的影响.观察药物作用前后宿主细胞表面F蛋白的表达.结果 温度转换前(黏附阶段)加入金欣口服液含药血清,实验组和对照组OD值无差异;温度转换后(侵入阶段)加入金欣口服液含药血清组OD值明显升高,与对照组比有显著性差异.荧光标记的F蛋白位于感染细胞表面,RSV 感染后,细胞发生融合的部位荧光明显增强,金欣口服液含药血清作用后荧光减少.结论 金欣口服液拮抗呼吸道合胞病毒的机制之一是抑制病毒的膜融合,作用位点是病毒的F蛋白或其受体.