重组BMP7腺病毒的构建及转染骨髓基质干细胞后的表达

根据Clonetech公司的腺病毒载体构建流程，原核表达载体pBlue-BMP7经一系列特定的限制性内切酶酶切，重组成BMP7的腺病毒载体，并转染293细胞进行大量扩增、滴度测定。重组Adeno-BMP7经限制性内切酶PI-SeeⅠ和Ⅰ-CeuⅠ双酶切获得BMP7基因片段，PCR扩增得到特异的扩增片段，表明重组的Adeno-BMP7载体构建成功，其中携带有目的基因BMP7cDNA片段。Adeno-Lac-Z的体外转染骨髓基质干细胞(BMSCs)，染色表明转染率可达90％以上；RT-PCR、免疫组化证明Adeno-BMP7转染BMSCs后BMP7在基因和蛋白水平上均有表达；转染Adeno-BMP7后的BMSCs细胞悬液裸鼠肌肉内注射后，X光片和组织学观察都表明BMP7转染可明显促进新骨的形成，与没转染Adeno-BMP7的BMSCs有显著差异。     

重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定

背景：有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP 4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道。 目的：构建重组人BMP-4/7 融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达。 方法：扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序。AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7。用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达。用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3 d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达。 结果与结论：PCR 电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7 基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功。RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P < 0.01)。结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景：利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。 目的：用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。 方法：将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2 cNDA和人成纤维细胞生长因子2 cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Wester blot 方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。 结果与结论：转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。     

不同基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性的影响

为了优化骨组织工程种子细胞，探讨不同基因对骨髓基质干细胞（MSCs）成骨活性的影响，我们首先利用RT—PCR方法获得了全长BMP-2．VEGF 165及bFGF基因，克隆入真核表达载体peDNA3．0，鉴定正确后，经脂质体介导转入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞，G418筛选出稳定表达株。并利用RT—PCR、免疫组织化学方法证明目的基因能够在骨髓基质干细胞中得到稳定表达。MTT实验结果显示转基因后的MSCs增殖能力有不同程度的提高。细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，BMP-2、bFGF转染组骨钙索水平升高，成骨活性增强。提示：BMP-2、bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞作为种子细胞能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达.方法 以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB-IL-6,经脂质体分别转染到PC...     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。 目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。 方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。 结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05)。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

反转录病毒介导基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景：间充质干细胞成骨分化早期是成骨性细胞外基质细胞外间质的堆积,其主要成分均是基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1(tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1,TIMP-1)作用的基质金属蛋白酶作用底物,通过增加TIMP-1的表达,是否可以抑制基质金属蛋白酶的活性,进而影响间充质干细胞的成骨分化能力？ 目的：观察反转录病毒介导TIMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力。 方法：设计In-Fusion引物扩增TIMP-1基因片段,与酶切后线性化的pBABE-Puro反转录病毒表达载体进行位点同源重组,构建TIMP-1基因反转录病毒表达载体,RT-PCR和测序验证,并使用GP-293细胞进行包装。通过密度梯度法分离人下颌骨来源骨髓间充质干细胞,流式细胞仪验证其表面标记。将TIMP-1反转录病毒包装液感染骨髓间充质干细胞并筛选稳定表达TIMP-1细胞株,RT-PCR和蛋白电泳验证其表达,并使用成骨诱导液诱导10 d,观察其对成骨能力的影响,RT-PCR验证其成骨相关基因的表达。 结果与结论：经测序证实,RT-PCR所获得的TIMP-1基因 cDNA 序列与NM_003254.2(624 bp)序列完全一致;通过表面标记鉴定证实成功分离了人骨髓间充质干细胞,并具良好的成骨、成脂能力;RT-PCR和Western Blot验证反转录病毒载体成功介导TIMP-1转染骨髓间充质干细胞,RT-PCR表明成骨诱导10 d时,TIMP-1基因感染组成骨增加,RUNX-2和COL1 mRNA表达增加。提示TIMP-1基因可通过反转录病毒成功转染人骨髓间充质干细胞,并能促进其成骨。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。 目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。 方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。 结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

骨髓基质干细胞BMP-2和bFGF基因的联合修饰

目的:建立能够稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,优化骨组织工程种子细胞。方法:通过RT-PCR方法获取全长BMP-2及bFGF基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后,经脂质体介导导入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞,G418筛选稳定表达株。利用RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫组织化学染色方法分析转染细胞外源基因表达情况。结果:成功构建了全长BMP-2及bFGF的真核表达载体,转染大鼠骨髓基质干细胞后经G418筛选获得稳定表达株。RT-PCR结果显示稳定转染细胞中具有大量目的基因mRNA转录,ELISA检测培养上清中目的蛋白表达阳性,Westernblot、免疫组化结果显示胞质中有目的蛋白的表达。结论:获得了可以稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,有利于组织工程骨缺损修复中的应用。     

GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用

目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 18筛选及扩增 ,获得大量含GFP基因的假病毒液 ,并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后 ,植入猪自体关节软骨缺损处 ,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果 :经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV GFP构建成功 ,转染PT6 7细胞后可在荧光激发波长下 ,发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～ 5 0 % ,经G4 18筛选后可达 10 0 %。筛选、扩增后 ,PT6 7细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损 7个月后 ,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示 ,多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论 :构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,能持久标记骨髓基质细胞 ,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪 ,该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞 ,并在软骨缺损的修复中发挥重要作用     

人骨形成蛋白7重组腺病毒载体的构建及其在牙周膜细胞中的表达

目的 研究腺病毒介导人骨形成蛋白7(BMP-7)基因转染人牙周膜细胞(PDLC)后目的 基因的表达及对人PDLC增殖的影响.方法 通过PCR扩增,获得BMP-7基因片段,酶切亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV-BMP-7上,在293细胞内和质粒pBHGE3同源重组得到腺病毒载体质粒Ad-BMP-7,PCR扩增目的 基因鉴定重组腺病毒,扩增纯化后测定滴度.体外培养人PDLC,Ad-BMP-7转染人PDLC,免疫印迹法(Westernblot)检测BMP-7的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测转基因细胞的增殖情况.结果 PCR显示BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1.785×1012 pfu/ml.Ad-BMP-7转染人PDLC后可检测到BMP-7表达.转染BMP-7对人PDLC增殖没有明显影响.结论 构建的BMP-7腺病毒表达载体可有效转染人PDLC,并在体外高效表达.     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞*

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP)转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。 结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞并促进其成骨分化的研究

目的　利用重组Runx2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,使其Runx2基因的表达水平提高,观察BMSCs成骨相关基因的表达情况,研究Runx2基因促进BMSCs的成骨分化情况。 方法　PCR扩增Runx2基因,并连接到慢病毒表达载体质粒Pez-lv201,与包装质粒共转染293T细胞进行包装,测得慢病毒液滴度。取4周龄SD大鼠胫骨,分离、培养BMSCs,流式细胞仪鉴定。将Runx2重组慢病毒感染BMSCs。显微镜下观察细胞形态变化;RT-PCR分析BMSCs成骨基因的表达情况。 结果　Runx2基因重组慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定正确。测得慢病毒液滴度为1.6×109 TU/ml。流式细胞仪检测表面抗原CD90和CD105,表达率为99.8%、99.3%。重组慢病毒感染后实验组细胞形态呈成骨样细胞改变;对照组未见明显变化。实验组Runx2、OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN基因的表达水平随时间推移而增高;对照组上述基因均无明显表达。 结论　利用Runx2重组慢病毒感染BMSCs,使其高表达Runx2基因,可以使OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN基因表达增强,说明Runx2基因可以促进BMSCs向成骨方向分化。     

真核表达载体PcDNA3.1-BDNF的构建及其在骨髓基质细胞中的表达

目的研究基因真核表达载体PcDNA3.1-BDNF的构建及其在骨髓基质细胞的转染和表达情况。方法以挪威大鼠BDNFcDNA为模板,PCR扩增BDNF全长编码基因,亚克隆至PcDNA3.1表达载体。将构建的重组质粒测序并通过脂质体转染到骨髓基质细胞中,RT-PCR鉴定BDNF基因的表达,Western blot检测BDNF蛋白的表达。结果 BDNF基因成功克隆到表达载体PcDNA3.1中,酶切鉴定片段为800bp,Western blot检测到BDNF在骨髓基质细胞呈阳性表达。结论真核表达载体构建成功,BDNF转染BMSCs后可稳定、高效表达。