突变人干扰素-α2b基因5'端提高其在大肠杆菌中的表达

目的 对人干扰素-α2b(hIFN-ao2b)基因的5'端进行突变,构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核高表达工程菌,以提高rhIFN-α2b的表达水平.方法 依据大肠杆菌密码子偏好性,在不改变hIFN-α2b的氨基酸序列的情况下,定点突变hIFN-α2b基因5'端序列并PCR扩增出rhIFN-α2b',克隆至温控型表达载体pJW2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,温度诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定分析并以WISH-VSV系统检测其抗病毒活性.结果 SDS-PAGE分析表明rhIFN-α2b表达量约占菌体总蛋白20.6%,Westem blot表明rhIFN-α2b具有与hIFN-α2b相同的免疫原性,WISH细胞-VSV病毒系统证实其比活性达1.2×108 IU/mg,与未突变工程菌一致.结论 突变hIFN-α2b基因5'端可以提高其表达水平,并成功构建出rhIFN-α2b原核高表达工程菌.     

人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化

目的 构建钠泵α2亚基第4跨膜区与第5跨膜区之间的蛋白结构域M4～M5的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化.方法 通过PCR反应和酶切技术,构建表达载体pET28b( + )-M4-5,并于大肠杆菌E.coli Rosetta 2进行表达,用6 mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到目的 蛋白,用Western blot分析表达产物,并采用无机磷法测定其ATP酶活性.结果 重组表达载体pET28b( + )-M4-5经酶切与测序鉴定证实构建成功;导入大肠杆菌Rosetta 2进行表达,表达产物相对分子质量为52×103左右,与预期值相符,表达量占细胞全蛋白的30%左右;SDS-PAGE分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,亲和柱纯化后,目的 蛋白的纯度在95%以上;Western blot分析表明表达产物与抗His抗体特异性结合;重组蛋白的ATP酶活性为(15.3±1.8)mmol·(g·h)-1.结论 构建了原核表达载体pET28b( + )-M4-5,并在大肠杆菌Rosetta 2中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的M4～M5融合蛋白.     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）的原核表达及分离纯化

目的 建立肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）原核表达系统.方法用生物信息学软件OptimumTM Codon优化密码子适应指数（CAI）、最优密码子频率（FOP）及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的 蛋白.结果 OptimumTM Codon获得优化后的FhSAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功,进一步实验结果表明FhSAP-2在pET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在pET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达.继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白.结论成功建立FhSAP-2的原核表达系统.     

hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :将天然型hIL 3蛋白经定点突变为hIL 3突变体蛋白 ,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法 :超声破碎细菌得到包涵体 ,经DEAEFastFlow,SephaecrylS 200HR等层析步骤纯化。结果 :经以上一系列纯化 ,得到的人IL 3突变体蛋白纯度达90 % ,比活性为7.3×104 U/ml ,总回收率为100 %。结论 :突变体hIL 3在大肠杆菌中得到高效表达 ,并获得高纯度、高活性的hIL 3蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的:在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法:将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Western blot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性. 结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Western blot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500 u/mg. 结论:高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.     

导向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建导向性IFN-α2a-α-MSH融合基因的原核表达载体,并建立重组蛋白的原核高效表达体系.方法:将本实验室已构建的pET-22b( )IFN-α2a-NGR用BamH Ⅰ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切,将得到的大片段与设计的α-MSH多肽片段退火后的产物进行连接,构建原核表达载体pET-22b( )IFN-α2a-α-MSH,将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达目的蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中成功实现了IFN-α2a-α-MSH的稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,采用超声裂菌的方法,用疏水作用层析技术获得较高纯度的重组蛋白.结论:成功克隆、表达和纯化了IFN-α2a-α-MSH蛋白.     

重组人血红蛋白δ链的制备与鉴定

目的克隆人血红蛋白δ(delta)链蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达,经纯化与鉴定,获得δ链蛋白,为建立β-地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从K562细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术获得目的片段并将其克隆到pET-32a及pET43.1a载体中,经PCR、酶切及测序验证,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以Ni2+亲和层析柱纯化,可溶性蛋白直接以Ni2+亲和层析柱纯化。采用Western Blot和ELISA分析鉴定表达产物。结果成功构建两种融合表达载体pET32-Hbδ及pET43.1-Hbδ,分别为包涵体表达和可溶性表达,纯化产物经Western blotting和ELISA鉴定均为δ链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化的人血红蛋白δ链,为后续的抗体制备及地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

幽门螺杆菌Tipα重组蛋白的表达?纯化及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌(H.polyri,HP)的Tipα基因,构建含有Tipα的重组载体,在大肠杆菌表达并纯化以获得Tipα蛋白。方法:从HP的26695菌株扩增位于HP0596的Tipα基因,将Tipα基因与pET28a载体(His标签)同时经BamHI和XhoI酶切、纯化及连接后,构建含有Tipα的重组载体pET28a-Tipα,重组载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物以Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot进一步鉴定。结果:克隆Tipα基因,经测序证实与Genbank对比,二者同源性为100%。大肠杆菌表达产物,纯化后SDS-PAGE显示相对分子量为23 ku。Western blot证实纯化产物与抗Tipα抗体特异性结合。结论:成功克隆并表达出HP的Tipα蛋白,为进一步研究Tipα的功能奠定基础。     

hIFN-λ1基因在大肠杆菌中的表达及其对角膜基质细胞的抗病毒作用

目的获取重组人干扰素-λ1（hIFN-λ1）的原核表达产物并研究hIFN-λ1对兔角膜基质细胞的抗单纯疱疹病毒（HSV）作用。方法用含基因重组表达载体pGEX-4T-λ1的大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和包涵体提取纯化后获取hIFN-λ1蛋白,采用微量滴定法测定其效价。采用组织块培养法培养兔眼角膜基质细胞,用微量细胞病变法比较hIFN-λ1、IFN-α标准品对兔眼角膜基质细胞的抗HSV作用。结果诱导含基因重组表达载体PGEX-4T-λ1的大肠杆菌BL21后,蛋白电泳显示出一条相对分子量约为33kd的蛋白条带;用IFN-α标准品校正其效价为62.5U/ml。hIFN-λ1抗HSV-I的作用与IFN-α相近,HSV-II的作用比IFN-α约弱50%。结论含基因重组表达载体pGEX-4T-λ1的大肠杆菌,经诱导表达和包涵体提取纯化后可获得hIFN-λ1,它对兔眼角膜基质细胞有一定的抗HSV作用。     

猪干扰素-γ基因在大肠杆菌中的克隆表达及其活性测定

目的在大肠杆菌中高效表达重组猪干扰素γ(porcineinterferongamma,poIFN-γ),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法选择大肠杆菌偏爱密码子人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因,克隆至原核表达载体pQE30中,IPTG诱导表达,表达产物经变性、复性、纯化后,测定其抗病毒活性。结果目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的84.5%,纯化后的纯度达到95%以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6.2×105U/mg。结论PoIFN-γ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物具有抗病毒活性。     

hTNFα寡聚组氨酸融合蛋白的表达

目的　利用大肠杆菌表达系统对人肿瘤坏死因子(hTNFα)的寡聚组氨酸(6×His)融合蛋白进行表达和纯化研究。方法　采用大肠杆菌表达系统的表达载体pET-28a(+)和pET-22b(+)表达了hTNFα的6×His融合蛋白,其6×His分别位于融合蛋白的N和C端,并利用寡聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质,经Ni2+-IDASepharose6B亲和柱对表达产物进行了纯化。结果　其表达量分别为菌体总蛋白的45%和8%。前者在胞内以不溶性包涵体存在,未对表达产物作进一步纯化;后者在胞质空间以可溶性存在,经亲和纯化的hTNFα-6×His纯度可达90%以上,得率为0.4mg/100ml,并对L929细胞具有杀伤的功能,其活力为5.42×104U/mg。结论　表达产物经纯化后具有细胞毒的活性。     

人重组MPIF-1(25-99)蛋白的纯化

目的：探索截短型髓样造血细胞抑制因子-1(MPIF—1)蛋白纯化的技术路线。方法：构建MPIF—1(25-99)-pMTY4原核表达载体，转化大肠杆菌后，用摇瓶培养，收获诱导菌，经破碎菌体一洗涤包涵体一溶解包涵体一复性初步纯化后，再经二步柱层析纯化。结果：获得了MPIF—1(25-99)的高效表达，表达量约占苗体总蛋白的30％。经纯化后，MPIF—1(25—99)蛋白的纯度达80％以上。结论：获得纯化的MPIF—1(25——99)蛋白。     

突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基基因的克隆表达与包涵体的复性

目的利用生物工程相关技术,获得不含Cys的突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基,为下一步蛋白质交联奠定基础。方法利用PCR定点突变技术扩增目的基因,并将之克隆到质粒PGM-T,转化大肠杆菌DH5α。经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性。结果通过SDS-PAGE分析,确定目的蛋白以包涵体形式存在。复性产率可达70%。结论此次实验所得到的目的蛋白的纯度与活性均满足蛋白质交联的需要。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

重组γ干扰素的表达与纯化

目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化方法,为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用ＤＮＡ重组技术把中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到析核表达质料ｐＢＶ２２０上,构建出ｐＢＶＩＦＮ高效表达载体,转化大肠杆菌ｐｌｙｓｓ。通过温度诱导,高效表达ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ。然后,经过包涵体溶解、复性、浓缩及ＤＥＡＥ离子交换层析,使γ干扰素纯化。结果 ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ表达水平占菌体     

利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸

目的构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶(re-MAP)的原核表达体系,并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)N末端的初始甲硫氨酸。方法将PCR扩增得到的大肠杆菌MAP基因克隆到表达载体质粒pACYCDuet-1中,并在宿主菌E.coli BL21中通过IPTG诱导进行可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot分析及活性检测后,通过两种方法作用rhIFN-α2b:①将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用;②构建reMAP和rhIFN-α2b的共表达体系,实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用,并对两种作用方式的结果进行比较。结果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正确表达,酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中体内作用切除率>94%、体外作用切除率>96%。结论 reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。     

干扰素联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎疗效观察

探讨干扰素(IFNα-2b)单用及联合胸腺肽应用对慢性乙型肝炎(CHB)的治疗效果和不良反应.方法:58例CHB患者随机分为联合组与干扰素组.联合组28例,采用IFNα -2b和胸腺肽联合治疗;干扰素组30例,单用IFNα-2b治疗.疗程均为3个月.结果:联合组与干扰素组在治疗结束时和停药3个月时血清丙氨酸转氨酶(A LT)水平均较治疗前明显下降(P＜0.01).停药后3个月HBeAg/抗-HBe转换率分别为60.71%和33.33%(P＜0.05),HBV-DNA阴转率分别为78.57%和53.33%(P＜0.05).79.30%的患者注射IFNα-2b时出现短暂发热和流感样症状,两组不良反应无明显不同.结论:IFNα-2b单独或联合胸腺肽治疗CHB均可取得较好的疗效;联合治疗有协同作用.     

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用

目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.     

人β淀粉样蛋白1-42在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达人源性β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42),纯化表达蛋白并进行Western blot鉴定。方法根据Gen Bank中人源性Aβ1-42编码序列,分为3个片段人工合成,经退火延伸为全长dsDNA序列,酶切后连接至表达质粒pET-28a(+)构建为重组质粒pET-28a-Aβ1-42,转化至大肠杆菌BL21株中,筛选高表达株,诱导表达,利用Ni+株亲和纯化表达蛋白,SDS-PAGE后,转印PVDF膜,进行Western blot鉴定。结果获得纯化的大肠杆菌表达蛋白Aβ1-42,表达形式为包涵体,经Western blot鉴定为人源性Aβ1-42蛋白。结论本研究获得了纯化的Aβ1-42蛋白,为下一步采用Aβ1-42标记该蛋白作为诊断分子奠定了基础。