荧光PCR检测副溶血性弧菌

[目的]建立荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速方法。[方法]根据基因库公布的副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因（TDH）的保守序列,设计一对引物,用FAM荧光剂标记探针的5＇,进行特异性和灵敏性分析,使用于食物中毒样品的快速检测。[结果]检测灵敏度为170.8fg/μl,菌液的灵敏度为30~70cfu/ml。用此反应体系检测53株副溶血性弧菌均出现特异的荧光信号,未见与其它试验种属细菌交叉。对3起食物中毒样品45份用荧光PCR法和国标法检测副溶血性弧菌,荧光PCR检测阳性22份,国标法阳性20份。荧光PCR检测从样品处理到结果只需8h。[结论]荧光PCR检测副溶血性弧菌灵敏度高、特异性强、简便快速,可用于副溶血性弧菌引起食物中毒的快速诊断和海产品副溶血性弧菌的快速检测。     

微生物实验室副溶血性弧菌能力验证结果分析

目的：通过能力验证来提高本实验室微生物检测能力,考核检测人员的技术水平,促进实验室质量管理体系进一步完善,保证日常检测结果的准确性、可靠性。方法：依据国家认证认可监督管理委员会（CNCA）能力验证计划《食品中副溶血性弧菌检测》（CNCA-09-B06）作业指导书和国家标准《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验）GB／T4789．7—2008中对副溶血性弧菌检测方法结合荧光PCR法对样品进行鉴定。结果：经分离鉴定和结合荧光PCR法：171a、171c样品中未检出副溶血性弧菌,171b、171d样品中检出副溶血性弧菌。结论：本次能力验证使用GB／T4789．7—2008,替代CB／T4789．7—2003中的检测方法,新标准中的检测方法更加合理、快速、特异。     

实时荧光定量PCR在副溶血性弧菌食物中毒检测中的应用探讨

目的:应用荧光定量PCR方法快速筛检副溶血性弧菌等食物中毒病原菌,以提高检测速度,与GB培养法比较,探讨两法的符合性和应用价值。方法:采用高度特异、敏感的实时荧光PCR作为初筛方法,用GB方法进行细菌分离培养,用ATB对分离到的病原菌进行鉴定。结果:21份食物中毒病人大便标本实时荧光定量PCR检出副溶血性弧菌特异性DNA核酸阳性18份,GB细菌培养检出18株副溶血性弧菌,两法的阳性符合率一致,检出率均为85.71%。结论:能用实时荧光定量PCR检测食物中毒中的病原菌。与GB培养法相比明显缩短检测周期,报告检验结果及时率提高,达到快速、及时的目的,在食物中毒事件中能更及时查明病因,对临床治疗、流行病学调查和食物中毒处置发挥积极作用。     

荧光实时PCR检测法在突发公共卫生事件的应用

目的:应用实时荧光PCR(real-time fluorescence PCR)方法及国标(GB)方法,对东莞市2006~2007年突发公共卫生事件中可疑食品及生物样品,检测食源性病原体,对两种方法的检出率及效率进行比较。方法:针对2006~2007年东莞市突发公共卫生事件,同时运用实时荧光PCR方法及国标方法对沙门菌(Sa)、副溶血性弧菌(Vp)、金黄色葡萄球菌(Sta)及志贺菌(Sg)等病原菌进行增菌、分离及鉴定,并将两者结果进行比较。结果:实时荧光PCR与GB两种检测方法对突发公卫事件中所涉及样品的目标病原体检出具有较好的一致性,两种检测方法对肛拭及粪便样检出率,实时荧光PCR方法要比GB法高,对Vp、Sg及Sa的检出也比GB法高。结论:实时荧光PCR与国标检测方法组成实验方案,准确、快速、简便、特异性强,为其应用于突发公共卫生事件中可疑食源性病原体检测奠定良好基础。     

荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病检测中的应用

目的:通过荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病菌检测中的应用,比较两种方法的敏感性、特异性、时限性、重复性。方法:2009年1月-2010年12月采集的样品进行常见食源性致病的细菌培养,随机抽取一部分样品进行荧光PCR检测。结果:细菌培养法在257份样品中检出单核细胞增生李斯特菌5株、金黄色葡萄球菌5株,检出率3.9%。所检出致病菌经荧光PCR法符合结果,符合率100%。随机抽取各类产品的20%共计49份样品进行沙门菌、大肠埃希菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等核酸试剂盒检测。结果检出沙门菌1份、金黄色葡萄球菌2份、单核细胞增生李斯特菌1份、副溶血弧菌1份,其余致病菌核酸检测均未检出,检出率10%。结论:与传统的细菌培养法相比,荧光PCR法可提高食源性致病菌的检出率、缩短检出时间、适用于食源性致病菌的检测。     

嘉兴市南湖区食品中食源性致病菌污染调查

目的了解食品中食源性致病菌的污染及菌相分布状况,为南湖区提供食品中致病菌污染资料,为食品卫生监督管理提供科学依据。方法依据国标方法,采用全自动微生物分析仪,对食品样品分别进行沙门菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、海鸥菌、肠出血性大肠杆菌(O157:H7)培养、分离及血清学、生化鉴定。结果共计检测食品样品148份,检出食源性致病菌42株,检出率28.38%。其中沙门菌6株、金黄色葡萄球菌7株、单增李斯特氏菌10株、副溶血性弧菌17株,海鸥菌2株。结论南湖区11种主要食品中存在食源性致病菌污染,以副溶血性弧菌污染最为严重,其次是单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌。     

2005～2006年秦皇岛市食源性疾病病原菌污染状况调查

目的：了解秦皇岛市食品中沙门菌、EHEC O157：H7、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、空场弯曲菌、金黄色葡萄球菌的污染状况,确定可能污染上述菌的高危食品,为食源性疾病的预防提供科学依据。方法：依据国标方法,采用进口显色培养基和生化鉴定试纸,对样品分别进行沙门菌、EHEC O157：H7、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、空场弯曲菌、金黄色葡萄球菌的分离、生化及血清学鉴定。结果：检测生肉、动物性水产品、散装熟肉制品、生食蔬菜、速冻米面食品、非发酵豆制品6类共240份样品,共检出病原菌37株,总检出率15.8%,副溶血性弧菌检出12株,检出率最高,为30%,沙门菌检出11株,EHEC O157：H7检出8株,单增李斯特菌检出6株,6类食品中动物性水产品病原菌阳性率最高,为30%,其次为生肉类,病原菌阳性率为28.8%。结论：秦皇岛市居民消费食品中存在食源性疾病病原菌污染,其中水产品和生肉是主要污染食品品种,副溶血性弧菌和沙门菌是污染食品的主要病原菌。     

一起副溶血性弧菌引起食物中毒的病原学鉴定及分型

目的对食物中毒事件中所采集样本进行副溶血性弧菌的分离鉴定,快速查明食物中毒原因并进行同源性分析。方法采用现行标准检验方法及实时荧光定量PCR对样本进行副溶血性弧菌分离鉴定;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离到的副溶血性弧菌进行分子分型。结果运用标准检验方法在22份食物样本中分离到副溶血性弧菌1株,7份粪便样本中分离到5株;实时荧光定量PCR在食物样本中检出核酸阳性1份,粪便样本中检出6份;所分离到的6株副溶血性弧菌经PFGE聚类分析得到4种PFGE带型,指纹图谱相似度为93.48%~97.44%。结论此次食物中毒由同一克隆副溶血性弧菌污染所致,PFGE可有效用于食物中毒的分型研究及溯源分析,实时荧光PCR可作为现行标准检验方法的有效补充。     

一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒

目的：由副溶血性弧菌所致食物中毒报告。方法：患者粪便19份,凉拼间刀、菜墩、冰箱壁样品各1份。参照《感染性腹泻诊断标准和处理原则》GB17012-1997和《预防医学微生物学及检验技术》进行检测。结果：19份粪便样品中,11份检出副溶血性弧菌,检出率为57.89%;所检出的11份副溶血性弧菌菌种经生化分型鉴定为同一生化型,神奈川试验阳性率100%。采集的凉拼间刀、菜墩、冰箱壁均未检出致病菌。结论：该次食物中毒是由副溶血性弧菌所致。     

应用多重实时荧光PCR方法确诊一起副溶血性弧菌所致食物中毒

目的采用多重实时荧光PCR对一起疑似食物中毒的样本进行快速检测,结合病原学的结果,确定病原体。方法2015年5月广西东兰县发生了一起疑似细菌性食物中毒。应用多重实时荧光PCR方法对留存食品和患者肛拭子标本进行副溶血性弧菌4种毒力基因的检测,同时对样本进行病原学检测。结果共检测15份食品样本和12份肛拭子标本,除了从1份肛拭子标本中分离培养出O3∶K6副溶血性弧菌外,其余标本均未分离出食源性致病菌。从8份肛拭子标本中检出副溶血性弧菌毒力基因,其中所有菌株均携带tdh、tlh和orf8基因,3株携带trh基因。结论这是广西首次利用多重实时荧光PCR技术确诊由副溶血性弧菌引起的食物中毒。多重实时荧光PCR方法可以同时鉴定和检测副溶血性弧菌及其毒力基因,具有快速、灵敏、准确的优点,可为食源性暴发事件提供快速、可靠的检测结果。     

应用筛检方法快速检测小海产品中副溶血性弧菌

目的:研究筛检海产品中副溶血弧菌方法,提高检出率和检测速度。方法:用PCR快速筛检,GB法寻找目标菌,以生化分步筛检作出初步确定,再经系统生化鉴定确认之。结果:356份海产品经筛检检出副溶血弧菌141株,检出率为39.61%,其中PCR一次性检出了141株副溶血性弧菌阳性基因,GB法分离到115株副溶血性弧菌,26株通过二次增菌才分离到,生化筛检与系统特殊化一致率达100%,检出带TDH毒力基因副溶血性弧菌5株,未检出TRH毒力基因。结论:应用发现PCR、GB和典型生化分步联合的筛检方法,可用于筛检食品中副溶血弧菌,具有快捷、大容量、方便的优点,为进一步开展食品多病原污染物监测工作打下了基础。     

浙江省某地海产品中副溶血性弧菌污染及耐药性分析

【目的】了解浙江省某区市售海产品中副溶血性弧菌污染状况及耐药性,为防控副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供基础数据。【方法】根据GB 4789.7—2013标准对海产品中副溶血性弧菌进行分离鉴定,利用实时荧光聚合酶链反应(PCR)法鉴定毒力基因,采用K-B法进行药敏试验。【结果】从210份样品中检出副溶血性弧菌阳性样本55份,检出率为26.19%,不同海产品种类检出率差异较大,腹足类和双壳类污染较为严重。分离所得的55株副溶血性弧菌均不含毒力基因tdh和trh,所有菌株均检出2种特异性基因tlh和toxR。大部分菌株对氨苄西林和阿莫西林耐药,耐药率均为96.36%。所有菌株对氨苄西林/舒巴坦、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、氯霉素完全敏感。【结论】市售海产品普遍存在副溶血性弧菌污染,分离菌株存在一定程度的耐药情况,应加强海产品副溶血性弧菌污染状况监测,规范养殖和临床抗生素使用。     

实时荧光定量PCR技术在副溶血性弧菌快速检测中的应用

目的:建立副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法,应用于食品、食物中毒样本的快速检测。方法:食品样本先选择性增菌,取上层液提取DNA,粪样直接提取DNA,用实时荧光定量PCR方法进行检测,并与常规培养法进行比较。结果:用实时荧光定量PCR检测食品54份,食物中毒粪样12份,检测阳性食品21份、粪样9份,检测结果与培养法比较,阳性检出率分别为食品38.9%、31.5%;粪样均为75.0%。结论:副溶血性弧菌的实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点。     

实时荧光PCR在食源性疾病中的应用

目的:探讨实时荧光PCR快速检测在食物中毒中病原学基因诊断的应用。方法:采用实时荧光PCR检测技术对一起副溶血性弧菌引起的食物中毒患者的粪便和肛拭增菌液进行快速检测,同时采用传统的分离方法和细菌生化鉴定仪的生化鉴定,及日本生研株式会社生产的肠炎溶血性弧菌型别免疫血清(K型别)分型。结果:在这一起食物中毒的患者中,实时荧光PCR检测6份粪便和肛拭增菌液,其中,4份阳性,并从PCR阳性的增菌液中分离到4株副溶血性弧菌K6型。结论:实时荧光定量PCR技术特异性强,灵敏度高,能在采样后数小时内检测到病原菌的DNA,达到快速诊断的目的,在食物中毒的快速诊断上起重要作用。     

深圳地区食物中毒低发期食品从业人员携带副溶血性弧菌的研究与分析

目的了解深圳某地区食物中毒低发期食品从业人员副溶血性弧菌携带情况。方法运用实时荧光PCR法快速检测肛拭子样本,阳性样本采用传统培养法进行分离鉴定。结果1200份食品从业人员肛拭子样本中,9份样本实时荧光PCR检测为阳性,PCR阳性率为0．8％。结论在食物中毒低发期,深圳某地区食品从业人员副溶血性弧菌携带率为0．5％。     

2018年北海市市售动物性水产品致病性弧菌污染状况调查

目的了解北海市动物性水产品中致病性弧菌的污染状况,为控制食源性疾病及食物中毒事件的发生提供依据。方法对北海市3个城区随机采集市场和超市销售的动物性水产品样本,参照《2018年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》中的微生物检验标准进行致病性弧菌检测。结果采集动物性水产品样品240份,检出致病性弧菌180份,总检出率为75.00%,其中海水产品的致病性弧菌检出率为91.67%,淡水产品的检出率为58.33%,海水产品的检出率高于淡水产品(χ^2=35.56,P<0.05)。检出4种致病性弧菌,其中副溶血性弧菌的检出率最高(57.92%),其次为溶藻弧菌(55.83%),创伤弧菌、河弧菌的检出率分别为10.83%和6.67%,未检出霍乱弧菌。海水产品副溶血性弧菌检出率(78.33%)高于淡水产品(37.50%)(χ^2=41.05,P<0.05)。检出的139株副溶血性弧菌均携带tlh毒力基因,tdh和trh两种毒力基因均未检出。结论北海市动物性水产品致病性弧菌污染较为严重,存在较大的食品安全风险,应加强水产品养殖和流通环节的致病性弧菌监测。     

深圳市水产品中副溶血性弧菌污染现状及耐药性分析

目的了解深圳地区不同季节水产品中副溶血性弧菌污染程度和耐药性,为控制副溶血性弧菌相关的食源性疾病提供依据。方法定期从市场抽取水产品,副溶血性弧菌的分离根据国标GB／T4789．7—2003进行,用GNID革兰阴性菌鉴定板进行生化鉴定,用法国梅里埃ATBFungs药敏反应板进行药敏实验。结果294份样品中检出副溶血性弧菌113株,检出率38．44％。夏秋季副溶血性弧菌的污染率明显高于冬春季（X2=5．62,P〈0．05。）。副溶血性弧菌对氨苄西林（AMP）、替卡西林（TIC）、头孢唑啉（KZ）的耐药率分别为65．47％、51．33％和43．36％。结论深圳水产品中副溶血性弧菌污染严重,在治疗相关食源性疾病时应合理用药。     

南京夏秋季海产品中副溶血性弧菌的污染监测及其毒力与耐药性

目的了解南京市夏秋季海产品中副溶血性弧菌(Vibro parahaemolyticus,VP)的污染状况以及分离菌株的毒力与药物敏感性。方法自农贸市场与饭店采取海产品样品,参考国标法(GB/T4789-2008)对样品进行检测,用科玛嘉弧菌显色培养基进行分离培养,对紫红色菌落进行PCR鉴定,对分离菌株进行神奈川试验与药物敏感试验。结果在296份样品中共检出副溶血性弧菌237株,检出率为80.1%,其中冷冻与保鲜海鱼类检出率为96.4%,贝壳类产品检出率为80.8%,鲜活鱼虾类检出率为6.7%,鲜海带类检出率为40.9%,海蜇类检出率为66.7%。VP种属特异性的基因tlh的PCR鉴定与显色培养基的鉴定结果一致;237株VP神奈川试验阳性69株;常用抗生素出现不同程度耐药,完全不耐药的分别为头孢曲松、头孢呋肟、万古霉素、美满霉素、奥复星、麦迪霉素、先锋霉素Ⅴ、丁胺卡那霉素、诺氟沙星、丙氟哌酸、复达欣等。结论南京夏秋季海产品中存在严重的副溶血性弧菌污染,分离菌株含毒力占29.1%,对16种抗生素存在不同程度的耐药。显色培养基用于海产品中副溶血性弧菌的快速检测与PCR检测结果一致。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

BAX实时荧光定量PCR法快速检测水产品中副溶血性弧菌

目的比较杜邦BAX System Q7全自动病原菌检测系统(BAX系统)和传统国家标准法(GB)检测生食水产品中副溶血性弧菌的效果,为快速而准确检测副溶血性弧菌提供依据。方法采用BAX系统检测84份水产品中的副溶血性弧菌,同时进行GB法检测。结果 2种检测方法的检测结果基本一致,副溶血性弧菌的检测符合率为100%。传统细菌培养法检出18株副溶血性弧菌,阳性率为21.43%,BAX实时荧光定量PCR法检出20株副溶血性弧菌,阳性率为23.81%。经统计学分析,2种检测方法差异无统计学意义(χ2=0.86,P0.05)。结论 BAX System Q7全自动病原菌检测系统对副溶血性弧菌的鉴定准确、快速、简单,适用于食品及应对突发事件中副溶血性弧菌的快速筛检。