抗磷酸酪氨酸抗体的制备、纯化和应用

目的 制备抗磷酪氨酸多克隆抗体,利用引抗体研究缺血再灌注对海马磷酸酪氨酸蛋白（ｐ－ｔｙｒ－ｐｒ）免疫反应性的影响。方法 以偶联磷酸化酪氨酸的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为免疫原免疫兔获得抗血清。将磷酸酪氨酸偶联到溴化氰活化的ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上。抗血清经到酪氨酸－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,所得抗体专一性强,并经ｄｏｔ ｂｌｏｔ鉴定。结果 抗体仅对酪氨酸磷酸化的蛋白质包括酪氨酸磷酸化的血清白     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人RBBP10多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组PTC-hRBBP10融合蛋白,表达产物以直链淀粉树脂亲合柱和superose 12凝胶柱过滤纯化,将纯化的PTC-hRBBP10偶联于NHS-activated SepharoseTM上,制备亲合层析柱,纯化兔抗人RBBP10多克隆抗体。结果①表达、纯化的PTC-hRBBP10的相对分子质量(Mr)为80×103,纯度为95%;②从抗血清中纯化获得可与PTC-hRBBP10特异性结合的兔抗人RBBP10多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗人RBBP多克隆抗体,为进一步研究该蛋白质的功能提供了条件,为肿瘤的诊断和治疗提供了新的理论和手段。     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

Flt3的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

Flt3(fms-like receptor tyrosine kinases)又称FLK-2(foetal liver kinase2)、STK-1(stem cell tyrosine kinase 1),为Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)成员之一,在血细胞中表达仅限于造血干/祖细胞表面,与其配体在正常造血及免疫系统发育中起重要的调节作用.     

亲环素A的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的构建人亲环素A(CypA)基因的原核表达载体,诱导表达、纯化蛋白,制备抗体,为进一步研究其生物学作用奠定基础。方法以人肺癌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增CypA基因片段,克隆到pMD18-T载体中。扩增产物与原核表达载体pET30a(+)连接,构建表达质粒pET30a-CypA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍树脂亲和层析柱High-Affinity Ni-IDA Resin纯化表达产物,SDS-PAGE检测纯化蛋白。用获得的蛋白免疫大白兔,制备抗CypA蛋白多抗,采用蛋白印迹法检测抗体特异性。结果成功构建了CypA的原核表达载体,经大肠杆菌诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到纯度达80.2%的融合蛋白,免疫大白兔后得到多抗血清。蛋白印迹结果显示此多克隆抗体能与CypA蛋白特异性结合。结论成功获得CypA纯化蛋白及CypA多克隆抗体,为进一步研究CypA在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法 利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp（384～661aa）的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a（＋）,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果 用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论 成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

抗NGAL抗体的制备、纯化及其鉴定

目的制备出一定纯度、免疫反应性好的抗NGAL抗体。方法采用纯的NGAL蛋白免疫动物,制备抗血清,然后进行硫酸胺沉淀法纯化抗NGAL抗体,最后运用SDS-PAGE、Western blotting分别鉴定抗NGAL抗体的纯度与免疫反应性。结果硫酸胺沉淀法纯化抗NGAL,SDS-PAGE检测分析表明抗NGAL抗体的纯度大于70%,Western blotting检测分析表明抗NGAL抗体的免疫反应性良好。结论最后获得了一定纯度、免疫反应性良好的抗NGAL抗体。     

FAAP的原核表达、纯化与抗体制备

目的 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,表达His-FAAP融合蛋白,制备FAAP蛋白的多克隆抗体.方法 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达His-FAAP融合蛋白,用纯化的FAAP蛋白免疫昆明小白鼠后,制备多克隆抗体,通过Western blotting检验抗血清的特异性和灵敏性.结果 成功构建pET28a-FAAP-His原核表达栽体.在大肠杆菌BL21中经1mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropy-β -D-thiogalactoside,IPTG)37℃诱导4h后,融合蛋白有很高水平的表达.Western blotting结果显示FAAP抗体能够有效地检测人血管内皮脐静脉细胞内FAAP蛋白的表达.结论 成功地对FAAP进行了原核表达、纯化,抗FAAP小鼠的多克隆抗体具有较好的特异性,为进一步研究FAAP的结构与功能奠定了坚实的基础.     

人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体蛋白PILRβ,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR从人的外周血细胞总RNA中反转录并扩增出PILRβ基因,将其克隆到表达载体pET-32a,在大肠杆菌中IPTG诱导表达,经Ni2 -NTA亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白多次注射免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体特异性.结果:获得了较高纯度的PILRβ蛋白(Mr约为42 000)及其抗体,多抗效价达到1:10 000,且特异性较好.结论:成功克隆了PILRβ基因并表达纯化了其蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究PILRβ蛋白的功能和潜在的药物开发打下了基础.     

兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体的制备与鉴定

目的制备兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体并进行鉴定。方法用人工合成的cTnI蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果此次获得的抗血清 ELISA方法检测抗体滴度达到了1:16 000,检测cTnI的灵敏度最低为10μg/L。Western blot检测表明该抗体可有效识别原核细胞表达及大鼠心脏组织提取物中存在的cTnI蛋白。结论应用该方法成功制备了人cTnI的多克隆抗体,为进一步研究cTnI的结构与功能打下基础,并为有效制备高特异性的单克隆抗体提供借鉴。     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的:表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体.方法:PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体,表达并纯化His-mTDG融合蛋白.用纯化的His-mTDG蛋白免疫兔子产生抗血清,进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体,并检测分析制备的抗体在Western blotting和免疫荧光分析中的应用.结果:在低温(20 ℃)和低IPTG浓度(0.2 mmol·L-1)时,His-mTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分,用亲和层析法分离纯化了His-mTDG蛋白,并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体,结果显示制备的抗体能够特异性地在免疫分析中使用.结论:本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白,制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体,为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础.     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

一个新的人信号识别微粒受体基因APMCF1的克隆、表达和抗体制备

目的：克隆人类新基因APMCF1，原核表达并制备其特异性多克隆抗体．方法：运用5’末端快速扩增方法，结合Genbank数据库进行电子拼接，完善APMCF1的5’端序列；利用RT-PCR方法，扩增出APMCF1的蛋白编码cDNA序列，克隆入pGEX-KG中，构建APMCF1的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达后获得了GST-APMCF1融合蛋白，以此融合蛋白为免疫原制备兔抗血清，用Western blot鉴定抗体特异性．结果：通过RACE及电子拼接，完善了APMCF1的5’端序列，其cDNA长度为1745bp，与鼠信号识别微粒受体β亚基序列同源性较高，染色体定位于3q22．2；克隆了APMC2F1 816bp的开放读框序列并表达了GST-APMCF1融合蛋白．制备了特异性兔抗GST-APMCF1多克隆抗体．结论：APMCF1可能是编码人类信号识别微粒受体β亚基的基因．该分子多克隆抗体的初步制备，为进一步研究APMCF1的功能提供了必要工具。     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

兔抗人NDR2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定

目的 制备高效价的NDR2抗体。方法 构建pRset-A-ndr2,pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b三种重组表达质粒，并分别在大肠杆菌中导表达相应的融合蛋白；用全长GST－NDR2蛋白免疫兔，然后用GST－NDR2－A和GST－NDR2－B片段加强免疫；对包涵体形式表达的6His-NDR2进行初步的纯化；利用固定于硝酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附纯化抗血清。结果 经免疫得到了高效价的兔抗人NDR2多克隆抗血清，亲和纯化提高了NDR2抗体的特异性；免疫组化表明NDR2是一种胞浆蛋白。结论 用全长NDR2蛋白免疫兔，再用片段加强免疫，可以提高蛋白的抗原性，制备得到高效价的抗体。纯化后的特异性NDR2抗体，为进一步研究NDR2的功能打下了必要的基础。     

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的：用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法：诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果：免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论：成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。