高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用

近年来，多肽药物化学形成并迅速发展成为药物化学的重要分支。而随着分离纯化技术的进展，又大大加快了新活性多肽的发现和合成速度。在多肽合成中．许多杂质显示与产物类似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得异常重要。本文综述了凝胶过滤色谱、离子交换色谱和反相色谱等高效液相色谱技术在合成多肽分离与纯化中的设计和应用。     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性

目的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 F(CTX F)并鉴定其活性。方法应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX F ,以SRB法观察CTX F对体外培养癌细胞的杀伤作用。结果眼镜蛇毒粗毒经凝胶过滤获得 4个蛋白峰 ,将CTX所在第Ⅳ峰用阳离子交换柱色谱获A、B、C、D、E、F和G等7个组分 ,其中E、F和G具CTX活性 ,将F组分再经凝胶过滤和疏水色谱进一步纯化得不含磷酯酶A2 (PLA2 )的CTX纯品 ,暂定名为CTX F ,它对多种癌细胞株有杀伤作用。结论应用凝胶过滤、离子交换和疏水色谱等方法可从眼镜蛇毒中获得不含PLA2 的CTX ,其组分F有抗肿瘤活性     

反相制备色谱分离酪丝亮肽拟似物

本文介绍了以反相C18制备色谱柱分离强极性小肽拟似物的方法。采用BuCHI中压制备系统，以水-甲醇为梯度洗脱体系，并配合HPLC检测，结果成功分离纯化了三个活性拟肽化合物，纯度达97％以上。该法简便、分离效果好，可用于该类小肽化合物的分离制备。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化研究

目的从赤子爱胜蚓(Eisenia Foelide)中分离纯化出一种相对分子质量(Mr)较小的纤维蛋白溶解组分———蚯蚓纤溶酶(EFE),为其注射剂的研制开发打下基础。方法采用盐析、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等方法分离纯化EFE,用SDS-PAGE对纯化的活性组分进行Mr测定,用酶谱分析方法初步探讨蚯蚓中存在的其它纤溶酶活性组分。结果分离纯化得到了EFE单一组分,经SDS-PAGE EFE呈单一条带,Mr约为25 000。经酶谱分析发现纤溶酶活性组分Mr分布在25 000~50 000之间。结论反复使用色谱技术可分离纯化EFE,并得到单一组分。     

眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、性质鉴定及细胞毒性测定

目的从眼镜蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶（LAAO）,测定其理化性质及细胞毒性。方法采用Superdex75凝胶层析、Phenyl-SepharoseFF疏水层析、ResourceS离子交换层析分离纯化LAAO;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及C18反相色谱鉴定纯度并测定相对分子量;CCK8法测定细胞毒性。结果舟山眼镜蛇蛇毒经凝胶层析、疏水层析、离子交换层析及C18反相色谱后获得LAAO（暂定名NA-LAAO）,在非还原和还原条件下相对分子质量均为58kD左右;具有明显的抑制人胃癌MGC-803细胞增殖作用。结论从眼镜蛇毒中纯化得到LAAO,其具有明显的细胞毒性。     

僵蚕抗凝成分仿生提取液的氨基酸序列分析

目的利用高效液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）对僵蚕胃蛋白酶提取液的有效抗凝成分进行结构分析。方法采用Hola C₁₈ (2.1mm×100 mm,2.7 μm)色谱柱, 以0.05%甲酸水溶液-0.05%甲酸乙腈溶液为流动相,梯度洗脱, LC-MS/MS正离子模式分析,初步探究抗凝活性成分的相对分子量和氨基酸组成。结果僵蚕经胃蛋白酶解得到相对分子量500~1000的活性肽,且多肽为低于10个氨基酸组成的低聚肽。结论僵蚕蛋白类组分通过酶解为活性低聚肽发挥抗凝作用,胃蛋白酶提取法更具科学性。     

牡蛎活性肽的制备及其理化性质的初步研究

目的从牡蛎蛋白质的酶解物中分离制备活性肽并对其理化性质进行初步研究。方法采用胰蛋白酶对牡蛎蛋白质进行酶解,使其释放出具备特殊活性的活性肽,将含有活性肽的粗提物分别用Sephadex G25凝胶柱层析,DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析和C18反相柱进行分离和纯化。结果牡蛎活性肽粗提物经过分离纯化制备出3个组分F31,F32,F41。组分F32,F41的等电点分别是7.12和7.08;组分F31,F32,F41的相对分子质量分别为885,810及409;其蛋白含量分别为51.9%,80.2%及99.8%;其糖含量分别为19.2%,4.3%及0%。结论以胰蛋白酶作用的最佳条件采用一步酶解的工艺,牡蛎蛋白质可以得到良好的酶解,同时得到的牡蛎活性肽粗提物活性较高。     

大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究

目的鉴定大鲵皮肤分泌液中抗菌肽,研究其部分生物活性。方法 5%醋酸浸提和Sephadex G-50、G-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化抗菌肽;采用抑菌圈法检测抗菌活性,Tricine-SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定其抗菌活性成份。结果大鲵皮肤分泌液中含有抗菌活性物质。对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌均具有较强的抗菌活性;电泳检测显示该小分子多肽相对分子质量约为4 300,具有较强的碱性。结论首次从大鲵皮肤分泌液中分离纯化到一种抗菌肽,此抗菌肽可能是一个具有较强阳离子特征的碱性肽。     

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的：改进分离工艺，找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法：五步蛇毒依次经SuperdexG75凝胶过滤、DEAE．SephroseF．F阴离子交换和SuperdexG30凝胶过滤，通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果：Superdex75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响；DEAE—SephroseF．FN离子交换色谱受盐浓度的影响：SuperdexG30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶，分子量约23kD。结论：依次经SuperdexG75、DEAE—SephroseF．F和SuperdexG30凝胶，通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件．最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。     

重组人红细胞生成素大规模制备中反相色谱的条件优化

目的优化重组人红细胞生成素(rhEPO)大规模制备纯化中主要影响回收率的反相色谱的条件,提高回收率。方法采用反相纯化作为三步法纯化的第一步,利用R1型反相填料采用不同分步洗脱条件进行洗脱。结果优化后经第一步反相色谱所得rhEPO蛋白纯度达70%,再通过阴离子交换和凝胶过滤色谱纯化,rhEPO终产物的纯度可达100%,体内比活达1.91×105IU/mg,rhEPO蛋白的回收率提高了1.2倍。结论优化的反相纯化条件(30%乙醇-1.5 mol/L尿素,60%乙醇-3.0 mol/L尿素)能更有效的从培养上清中大量纯化出rhEPO,回收率高。获得的产品纯度高,体内外活性好。适合大规模纯化。     

云南小狭口蛙促胰岛素释放肽的分离纯化与结构鉴定

通过葡聚糖Sephadex G-50凝胶过滤和反相高效液相析(RP-HPLC)等手段,对云南小狭口蛙(Callueslla yunnanensis Boulenger)皮肤分泌液进行分离纯化,得到了有促胰岛素释放活性的多肽分离峰.运用质谱仪测定该促胰岛素释放肽的相对分子质量为1 768.08,一级结构鉴定测得其氨基酸基...     

液相色谱色谱填料选择性的研究方法

反相液相色谱(RPLC)是药物分析和分离纯化过程检测的首选方法,选择合适的色谱柱是检测方法的关键.本文综述了C18色谱柱及高交联度聚合物色谱柱选择性研究的一些方法,包括溶剂三角形法,相似系数法,选择性比较法,logK值法和类正相模式法.这些研究方法从本质上研究了色谱柱选择特性的物质基础和影响选择性的因素.高交联度聚苯乙烯色谱柱的研究也可以为分离纯化中常用的吸附树脂选择特性的研究提供借鉴.     

链霉菌I08A1776产生的水溶性链丝菌素

目的分离纯化链霉菌I08A 1776发酵液中的水溶性抗耐药结核活性成分。方法利用离子交换、反相和亲水作用等多种色谱技术进行分离纯化,通过现代波谱学方法鉴定活性成分结构。结果分离得到3个水溶性活性成分,其结构分别确定为链丝菌素E(1)、Nβ-乙酰链丝菌素E(2)和Nβ-乙酰链丝菌素D(3)。链丝菌素E(1)对结核分枝杆菌H37Rv和临床分离耐药株的MIC值为0.25~1.0μg/mL。结论首次利用亲水作用色谱分离纯化微生物发酵液中的水溶性活性化合物。亲水作用色谱在微生物水溶性次级代谢产物的分离纯化中具有广阔的应用前景。链丝菌素E具有较强的体外抗耐药结核分枝杆菌活性。     

蜈蚣三七有效成分W3的提取分离及其免疫活性的初步研究

目的研究蜈蚣三七有效成分W3的提取分离方法及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。方法利用硅胶柱和C18色谱柱分离纯化W3,采用四甲基偶氮唑蓝法分别检测蜈蚣三七总皂苷、W3及齐墩果酸分别对小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应的影响。结果 W3对正常增殖的淋巴细胞活性无明显影响;剂量不低于0.1μmol/L时,W3对刀豆蛋白诱导的淋巴细胞增殖活性有显著抑制作用（P〈0.05）。结论蜈蚣三七有效成分W3具有较强的免疫活性。     

山羊脾脏多肽的分离纯化

目的：分离纯化由山羊脾脏中获得的多肽。方法：用传统方法从山羊脾脏中提取多肽，应用Spherisor C18色谱柱和乙腈溶液组成的HPLC色谱系统，检测波长214nm，对山羊脾多肽进行分离，并对此多肽的各组分进行分离峰收集；对所收集的各组分进行纯度分析。结果：由上述色谱系统可分得3种组分，分别命名为PGS-1、PGS-2、PGS-3。结论：由山羊脾脏中获得的多肽是由疏水性不同的3种成分组成的物质。     

人胎盘抗凝蛋白的分离纯化及鉴定

目的　从人胎盘中分离纯化一种胎盘抗凝蛋白 (theanticoagulationprotein ,PAP) ,并对其生化性质进行研究。方法　用饱和硫酸铵分步盐析、阴离子交换、凝胶过滤和亲和层析方法分离纯化人胎盘抗凝蛋白 ,用活化部分凝血活酶时间 (APTT)测定其抗凝活性 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)测定其蛋白分子量 ,用等电聚焦法测定蛋白的等电点。结果　从人胎盘中分离纯化出相对分子质量约为3 4 9× 1 0 4,等电点约为pH4 9的单聚体抗凝蛋白。该蛋白能延长APTT时间 ,且延长的时间与剂量成线性关系 ,得率占胎盘总重量的 0 0 1‰。结论　此方法成功地从人胎盘中纯化出一种抗凝蛋白。该蛋白的性质与膜联蛋白Ⅴ比较相似 ,可能是属于膜联蛋白家族     

短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白的分离纯化及鉴定

目的从短尾蝮蛇毒中分离纯化一种抗凝蛋白,并对其生化性质进行研究。方法利用阳、阴离子交换、凝胶过滤的方法分离纯化这种抗凝蛋白,用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定其抗凝活性,用SDS-PAGE测定其蛋白相对分子量,用等电聚焦法测定蛋白的等电点.用薄层析方法确定抗凝蛋白与磷脂酰胆碱结合。结果从短尾蝮蛇中分离纯化出的抗凝蛋白是二聚体,相对分子量为24.0×103(非还原)和14.6×103(还原)。等电点为pH 5.2。该蛋白具有精氨酸酯酶活性,能明显地延长活化的部分凝血活酶时间(APTT),其抗凝活性与磷脂结合有关。结论此方法成功地从短尾蝮蛇毒中纯化出一种抗凝蛋白。因其能够与磷脂结合,又具有明显的抗凝活性,因此把该蛋白称为磷脂结合抗凝蛋白(phospholip id-b ind ing anticoagu lation prote in,PBAP)。     

哇巴因多克隆抗体F(ab)_2片段的制备及其分子量测定

目的制备哇巴因多克隆抗体F(ab) 2 片段 ,并对其进行分子量的测定。方法免疫家兔制备哇巴因多克隆抗体 ,在适宜的条件下 ,用胃蛋白酶酶解哇巴因多克隆抗体 ,制备F(ab) 2 片段。酶解产物经HPSEC分析、纯化 ,ELISA法检测其免疫学活性。并在适宜的色谱条件下 ,分别测定三种标准蛋白的洗脱体积 ,绘制标准曲线 ,测定其分子量。结果 10 0mg哇巴因多克隆抗体在 2mg胃蛋白酶消化 18h ,反应体系pH 3 .0的条件下消化 ,制备出了活性的F(ab) 2 片段 ,其相对分子质量为 10 7kD。结论用胃蛋白酶消化哇巴因多克隆抗体 ,可制备出活性的F(ab) 2 片段 ,同时其相对分子质量的测定为其进一步研究提供了依据。     

一种蛹拟青霉代谢产物中抗肿瘤活性组分的分离纯化

目的对一种蛹拟青霉代谢产物中抗肿瘤活性组分进行分离纯化。方法通过最佳展开剂的选择,找到硅胶柱色谱系统的最佳洗脱条件,粗分离后的供试品通过凝胶柱色谱系统分离纯化得到纯供试品。结果分离纯化得到的供试品纯度均大于95%,通过后期的体外抗肿瘤实验,证明具有良好的肿瘤细胞抑制率。结论硅胶柱色谱和凝胶柱色谱的混合利用可以提高供试品的分离纯化效果。     

中华真地鳖抗肿瘤蛋白纯化、鉴定及活性研究

目的分离纯化中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)中抗肿瘤活性成分并研究其活性。方法采用硫酸铵沉淀、超滤、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF及Q-Sepharose HP离子交换、Butyl Sepharose HP疏水色谱以及Superdex 75凝胶过滤色谱等技术分离纯化抗肿瘤组分;SDS-PAGE及MALDI-TOF质谱进行鉴定;采用MTT法考察其抗肿瘤活性。结果分离纯化得到一分子质量约为72 kD的抗肿瘤蛋白(EPS72)。该蛋白对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用,并呈浓度依赖性。结论纯化的蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。