缺氧诱导因子-1在心肌保护中的作用

缺氧诱导因子-1 （hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是一种依赖于氧调控的转录因子,其在维持氧稳态方面发挥重要作用。缺氧时,缺氧诱导因子-1可以稳定地表达,从而调控一系列缺氧相关基因的表达,其诱导表达的基因与能量代谢、细胞生存与增殖、血管新生、红细胞生成、肿瘤生长以及肿瘤多药耐药等相关。许多心脏疾病都有不同程度的缺氧,机体可对其产生一定程度的代偿。HIF-1是在心肌缺氧中起代偿作用的重要因素,其机制可能涉及缺血缺氧时HIF-1能够促进血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶、血红素氧合酶-1、内皮素-1和心房钠尿肽等基因的表达,从而发挥心肌保护作用。     

心肌营养素—1的研究进展

心肌营养素 1(CT 1)是一种新近发现的细胞因子 ,属于IL 6家族。人CT 1mRNA编码 2 0 3个氨基酸 ,以gp130和LIFR为受体。CT 1通过JAK /STAT3信号转导途径诱导心肌肥大 ,p2 4/p44MAPK途径保护心肌。CT 1也能维持神经元存活 ,并有IL 6样生物学功能。     

心肌营养素-1在心肌成纤维细胞增殖中的作用

目的：探讨心肌营养素-1（CT-1）在高血压心室重塑中的作用。方法：3-4代心肌成纤维细胞用于实验，分为对照组、助溶剂（二甲亚砜，DMSO）组、CT-1反义寡核苷酸组（ASODN）、正义寡核苷酸对照组（SODN）、PD98059组、AG490组、LY294002组。利用自制压力培养装置，将各组细胞置于160 mmHg压力下培养8 h。 STAT3、ERK1/2和PI3-K的活性通过Western blotting分析测定；MTT测定心肌成纤维细胞增殖。结果：高静水压明显促进心肌成纤维增殖，CT-1表达上调，CT-1ASODN干预后，CT-1ASODN能抑制高静水压所致的细胞增殖（0.132±0.013 vs 0.154±0.011，P<0.05），STAT3、ERK1/2和 PI3-K蛋白表达水平明显低于对照组（2.09±0.25 vs 2.47±0.28,P<0.05)、(1.13±0.19 vs 1.61±0.22,P<0.05)、（1.25±0.23 vs1.71±0.25,P<0.05)。AG490组明显减弱高静水压的促增殖作用（0.118±0.018 vs 0.155±0.010，P<0.05）并且增加ERK1蛋白磷酸化（1.85±0.18 vs 1.45±0.23，P<0.05）;PD98059增强高静水压的促增殖（0.185±0.011 vs 0.155±0.010，P<0.05）并且增加STAT3蛋白磷酸化（1.83±0.23 vs 1.58±0.22，P<0.05）, PI3/K阻断剂LY294002干预后对高静水压的促增殖作用无影响（0.157±0.015 vs 0.155±0.010，P>0.05）；SOND (0.151±0.010 vs 0.154±0.011, P>0.05) 和DMSO组(0.141±0.017 vs 0.155±0.010, P>0.05)与对照组相比对心肌成纤维细胞增殖无明显差别。结论：高静水压下，心肌成纤维细胞增殖主要通过STAT3通路；ERK1/2通路通过抑制STAT3的活性起负向调节作用，可能在防止心肌成纤维细胞过度增殖起重要的作用；PI3-K没有参与这一作用。上述STAT3通路与ERK1/2通路之间的相互作用可能有助于防止诱导成纤维细胞过度增殖。     

NADPH氧化酶亚单位nox-1在心肌细胞急性缺氧复氧损伤时的变化及心肌营养素-1的作用

目的： 探讨心肌细胞急性缺氧复氧损伤时NADPH氧化酶亚单位nox-1的变化及心肌营养素-1的作用。方法: 用改良的方法培养出生1-３ d的乳鼠心肌细胞,分为6组：(1)对照组;(2)缺氧复氧组;(3)缺氧复氧+CT-1组;(4)缺氧复氧+CT-1+LY294002组 (PIK3/Akt 阻断剂);（5）缺氧复氧+CT-1+PD98059组（ERK 阻断剂）;（6）缺氧复氧+CT-1+助溶剂DMSO组。 CT-1 的浓度为10 μg/L。MTS法测定心肌细胞的存活率,四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物（JC1）检测心肌细胞线粒体膜电位(Δψm),二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-CA）检测细胞活性氧（ROS）,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。Nox-1蛋白采用Western blotting检测。结果: 缺氧复氧培养后心肌细胞凋亡率及细胞内ROS较对照组明显增加,分别是(19.7%±1.4% vs 2.1%±0.5%, 14.07%±1.25% vs 3.54%±0.86%, P<0.05),而心肌细胞存活率显著降低,线粒体膜电位（Δψm）下降;nox-1表达明显升高。CT-1处理的心肌细胞,较缺氧复氧组心肌细胞存活率明显上升 (87.0%±7.3%),而心肌细胞凋亡率及细胞内ROS 显著减少,Δψm水平增加,nox-1蛋白表达下调。而CT-1的这些作用能被PIK3/Akt和ERK阻断剂抑制。结论: 心肌细胞急性缺氧复氧损伤时NADPH氧化酶亚单位nox-1表达上调,而心肌营养素-1能通过下调nox-1表达,发挥对心肌细胞保护作用。     

大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因的原核克隆表达和免疫学分析

目的 克隆表达大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因(SOCS-1).方法 将大鼠SOCS-1全长编码基因的PCR产物,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1.转化大肠埃希菌BL-21/DE3,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用镍离子金属螯合剂亲和层析柱从表达产物中纯化重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物和重组蛋白进行鉴定.应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,抗体滴度达到1:10000以上后进行末次免疫,2周后心脏取血、测定滴度,分离制备免疫血清.用红细胞裂解法制备大鼠外周血白细胞裂解全蛋白.将阴性血清(未用重组蛋白免疫的新西兰大白兔的血清)、免疫血清及兔抗组氨酸标签抗体转入各蛋白条带,用Western免疫印迹检测重组蛋白的免疫学活性.结果 PCR、双酶切及DNA测序分析均表明重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1构建成功.SDS-PAGE结果可见转化了重组质粒的大肠埃希菌全菌和经超声裂解后的菌体沉淀的样品均在相对分子质量约26 000处有一明显的蛋白条带,经亲和层析获得的纯化重组蛋白有特异的单一条带与上述条带一致,而在超声裂解后的菌体上清中相同位置却未见有蛋白表达条带.Western免疫印迹表明重组蛋白、大鼠外周血白细胞裂解蛋白中相对分子质量约24000的蛋白条带、兔抗组氨酸标签抗体均可被免疫血清识别,分别出现清晰的相对分子质量26000、24 000、26000的反应条带,表明其具有免疫活性.结论 SOCS-1基因可以在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得表达,其纯化重组蛋白具有良好的抗原性和免疫活性.     

心肌营养素1诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的: 探索心肌营养素1(CT-1)对小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的影响。方法: 获取、扩增稳定的成体西藏小型猪MSCs,鉴定成脂、成骨潜能。分4组诱导向心肌样细胞分化,包括空白对照组、5-氮杂胞苷(5-Aza)组、CT-1组、5-Aza和CT-1合用组。取诱导后4周的细胞加肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)抗体,进行免疫荧光染色,最后计数红色荧光阳性染色率。结果: 分组诱导分化结果,合用组的诱导分化心肌样细胞α-actin阳性率为29.90%±4.76%,明显大于5-Aza组(17.73%±2.35%,P<0.01)、CT-1组(6.63%±0.55%,P<0.01)和空白对照组(1.62%±0.09%,P<0.01);5-Aza组明显大于CT-1组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01);CT-1组明显大于空白对照组(P<0.05)。cTnT红色荧光染色结果显示:合用组的诱导分化心肌样细胞cTnT阳性率为36.50%±4.09%,明显大于5-Aza组(14.37%±1.65%,P<0.01)、CT-1组(7.50%±0.61%,P<0.01)和空白对照组(1.12%±0.23%,P<0.01);5-Aza组明显大于CT-1组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01);CT-1组明显大于空白对照组(P<0.01)。结论: 适宜浓度的5-Aza(10 μmol/L)和CT-1(0.1 μg/L)能够在体外诱导小型藏猪骨髓MSCs转化为心肌样细胞,诱导后的细胞获得部分心肌细胞特异性蛋白的表达。CT-1与5-Aza联合可明显提高诱导率。     

转化生长因子-β1对肾小球上皮细胞金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响

目的 :探讨大鼠肾小球上皮细胞MMP - 2、- 9/TIMP - 1、- 2的表达情况 ,以及TGF - β1体外对GEC表达MMP/TIMP的影响。方法 :(1)明胶酶谱法测定体外培养大鼠的肾小球上皮细胞株的MMP - 2、MMP - 9的活性。 (2 )Northernblot/RT -PCR方法观察TGF - β1影响上皮细胞表达TIMP - 1、TIMP - 2、MMP - 2及MMP - 9的时间效应和浓度效应。结果 :(1)明胶酶谱分析显示 :①大鼠肾小球上皮细胞能分泌MMP - 2及MMP - 9等明胶酶 ,并受TGF - β1的调节。TGF - β1对GECMMP - 2、MMP - 9酶活性的调节具有量效、时效关系。②TGF…     

肝细胞生长因子激活因子抑制因子-1的表达与功能

肝细胞生长因子激活因子抑制因子-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor type1,HAI-1)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子,定位于细胞的基底侧,具有膜型和分泌型两种形式,能有效抑制肝细胞生长因子激活因子HGFA和丝氨酸蛋白酶Matriptase的活性,参与HGF/c-Met信号传导途径调节。HAI-1在包括妊娠、再生及肿瘤等各种正常生理及病理状态下均有不同水平的表达,其表达水平的变化以及其与靶蛋白酶表达比例的变化直接影响到靶蛋白酶的活性,从而在调控个体发育、血管生成、组织损伤修复以及抑制肿瘤的侵袭性生长等生理和病理过程中发挥重要作用。     

慢性低氧时小鼠肺组织低氧诱导因子-1α的表达

目的：研究低氧时小鼠肺组织中低氧诱导因子-1α(HIF-k)表达的变化。方法：实验用雄性小鼠,低氧仓浓度分别为10％、7％、5％。用免疫荧光组织化学技术及共聚焦显微术,检测小鼠在低氧条件下肺组织中HIF-1α表达的变化。结果：正常组小鼠肺组织HIF-1α无表达,低氧组HIF-1α表达增加,且随低氧时间的延长及低氧强度的增加而增强。结论：低氧可诱导小鼠肺组织中HIF-1α的表达增强,(HIF-k)可能参与肺组织细胞凋亡的发生。     

Sirt1参与异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大

目的:观察Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶1(Sirt1)在异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥大中的表达及作用。方法:昆明小鼠随机分为正常对照组、ISO模型组和ISO+NAM(烟酰胺,Sirt1抑制剂)组。皮下注射ISO诱导小鼠心肌肥大。以心脏重量指数(心脏重量/体重)、HE染色、透射电镜以及脑钠肽(BNP)mRNA表达水平观察心肌肥大的变化。同时采用RT-PCR、Western blotting检测各组心肌Sirt1 mRNA、蛋白质的表达。结果:与对照组相比,心脏重量指数,HE染色,透射电镜以及BNP mRNA表达水平均显示皮下注射ISO可明显诱导小鼠心肌肥大;Sirt1在心肌肥大模型组表达显著增多(P0.01),其抑制剂NAM可明显减轻ISO诱导的心肌肥大(P0.05),并降低Sirt1的表达(P0.01)。结论:Sirt1的激活可能参与ISO诱导的小鼠心肌肥大。     

心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用

背景：心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。 目的：探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。 方法：取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组：谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。 结果与结论：谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72 h MTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

人神经营养素-3全基因在大肠杆菌内的表达

目的　应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为研究hNT 3的生物学作用和开展应用hNT 3进行中枢神经损伤和退行性疾病的治疗提供材料。方法　将经过序列分析确定的hNT 3全基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体pBV/hNT 3,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定目的蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。结果　pBV/hNT 3在大肠杆菌中表达出了三个分子质量分别为 1 5× 1 0 3、1 8× 1 0 3和 33× 1 0 3的蛋白质 ,恰与hNT 3蛋白、其前导肽及前体的分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的存活和神经元突起的生长。结论　人神经营养素 3全基因可在大肠杆菌内正确地转录和翻译 ,并可部分性地进行加工     

Wee1基因在大鼠生后发育不同阶段与压力负荷后心肌组织的差异表达

目的检测wee1基因在大鼠生后不同发育阶段和压力负荷性心肌肥大心肌组织中的表达情况,探讨心肌细胞增殖调控的相关机制。方法采用升主动脉缩窄方法制作压力负荷性心肌肥大动物模型,采用RT-PCR技术检测大鼠生后不同发育阶段和肥大心肌组织wee1基因的mRNA表达。结果 wee1基因在大鼠生后0天呈低表达,生后第3天高表达(P<0.01),之后至成年呈低水平表达;与假手术组相比,压力负荷性肥大心肌组织wee1基因表达水平明显上调(P<0.01)。结论 wee1基因在大鼠生后发育过程中和在压力负荷性心肌肥大组织呈差异表达。     

Wnt抑制因子-1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因小鼠中的表达变化

目的 检测Wnt抑制因子-1(Wif-1)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型小鼠脊髓内的表达变化,进一步探讨Wif-1在ALS发病中的作用.方法 选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各54只,分别于鼠龄95d、108d、122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定、分离脊髓、制备冷冻切片,应用免疫荧光染色技术...     

过表达c-SKI抑制异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化

目的 探讨原癌基因c-SKI在异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌纤维化中的作用及机制.方法 将小鼠分为对照组(control组)、模型组(model组)、c-SKI基因感染模型组(LV-SKI组)及对照病毒感染模型组(LV-NC组),每组10只.模型组采用皮下注射ISO 30 d,首次剂量为5 mg/kg,后续以2....     

缺氧诱导因子-1在缺氧预处理心肌保护中的作用及其机制研究

目的:研究缺氧诱导因子-1(HIF-1)在缺氧预处理(HPC)心肌细胞保护中的作用及其机制。方法:在培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型上,观察HPC对于24h后心肌细胞H/R损伤的影响,以MTT法测定心肌细胞存活率,试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。制备心肌细胞蛋白提取物,以磷酸化的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)抗体测定HPC后不同时间ERK1/2活性,以聚丙烯酰胺电泳迁移实验观察HIF-1α磷酸化,并观察蛋白磷酸酶激动剂BDM和ERKs的上游激酶(MEK1/2)抑制剂PD98059对于HPC诱导的HIF-1α磷酸化以及心肌细胞保护作用的影响。结果:HPC可以提高心肌细胞H/R后存活率、减少LDH漏出,并激活ERK1/2,使HIF-1α发生磷酸化;蛋白磷酸酶激动剂BDM和ERKs的上游激酶MEK抑制剂PD98059可以消除HPC诱导的HIF-1α磷酸化和心肌细胞保护作用。结论:HPC可以提高乳鼠心肌细胞对于H/R的耐受性,其机制涉及ERKs介导的HIF-1α磷酸化。     

人参皂甙Rb1对PGF2α诱导心肌肥大的作用

目的 :观察人参皂甙Rb1对PGF2α诱导心肌细胞肥大的作用 ,并讨论相关机制。方法 :利用PGF2α诱导乳鼠心肌细胞肥大模型 ,观察Rb1的作用 ,并分别加入钙调神经磷酸酶 (Calcineurin ,CaN)抑制剂环孢素、酪氨酸激酶抑制剂herbimycin、一氧化氮合成酶抑制剂L NAME ,观察该作用的变化。结果 :PGF2α1 0 7mol·L 1使心肌细胞直径、蛋白含量及心房利钠肽水平明显增加 ,Rb1 2 0 0、1 0 0及 5 0 μg·mL 1剂量依赖地抑制PGF2α的心肌肥大作用。环孢素A可明显阻断Rb1对PGF2α的作用 ,但herbimycin及L NAME对该作用无明显影响。结论 :人…     

细胞因子信号转导抑制因子3在脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的表达

目的 探讨细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)在脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的表达情况及其可能的作用机制.方法 采用盲肠结扎并穿刺术(CLP)制作小鼠脓毒症模型.检测肝脏和脾脏组织的SOCS3 mRNA及蛋门表达,采用RT-PCR检测组织中SOCS3 mRNA的相对含量,用免疫印迹方法测定组织中SOCS3相对蛋白含量.用SPSS统计软件对上述指标间的变化关系进行分析.结果 脓毒症手术后SOCS3在肝脏内基因和蛋白表达量有升高趋势,但与对照组比较筹异无统计学意义(P>0.05).SOCS3在脾脏内的基因和蛋白表达在术后2 h迅速升高.至12 h达峰值.在肝脏和脾脏中SOCS3的基因表达和蛋白表达均正相关(r=0.353、0.731,P均<0.05).结论 CLP导致的脓毒症可以诱导SOCS3在小鼠肝脏和脾脏中表达增多,提示SOCS3在脓毒症后的免疫变化中有重要作用.     

5-氮胞苷诱导体外培养的胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的研究5-氮胞苷(5-aza)体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的可行性。方法将P19细胞接种于培养板中或铺有琼脂的培养板中,5μmol/L5-aza培养7d后用不含5-aza的培养基继续培养。倒置显微镜观察细胞跳动情况,用免疫细胞化学、RT-PCR检测及电镜观察等方法鉴定细胞分化。结果5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞分化为有节律跳动的心肌细胞。分化的细胞表达心肌特异的GATA-4、α-MHC mRNA及α-sarcomeric actin、cTnT蛋白,同时透射电镜观察到细胞质内有明显的肌丝。结论5-aza在体外可诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化,悬浮培养有助于细胞的心肌化过程。     

分化抑制蛋白1在小鼠树突状细胞肉瘤细胞分化中的作用

目的 研究降低分化抑制蛋白1(Id.1)的表达在树突状细胞肉瘤(DCS)细胞分化中的作用.方法 通过RNA干扰技术来降低DCS细胞株中Id-l蛋白的表达,Western blot和real.timePCR分别检测该蛋白在蛋白水平和mRNA水平L的变化;倒置显微镜下观察降低Id.1蛋白表达后DCS细胞形态的变化;Casy细胞计数分析仪检测细胞大小的分布情况;流式细胞仪检测细胞周期的变化.通过Western blot和免疫组织化学检测树突状细胞的分化标志如Id-2、CD86、CDllc、MHC II的变化.生长曲线及四甲基偶氮唑盐(MTY)法检测DCS细胞的增殖情况的变化;通过TransweH和克隆形成率测定分别观察降低Id-1蛋白前后细胞侵袭、成瘤能力的变化.以不加siRNA的空白组和无关 对照siRNA作阴性对照,以诱导分化剂丁酸钠作为阳性对照.结果 降低Id-1蛋白表达后DCS细胞分枝增多,细胞体积明显增大,核质比下降,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少(P<0.01),树突状细胞分化标志Id-2、CD86等表达上调,细胞增殖受到抑制,侵袭、成瘤能力减弱(P<0.01).结论 通过RNA干扰技术降低Id-1基因的表达,可以促进恶性实体肿瘤细胞的分化,降低恶性程度.