杭白菊提取液对抗缺血再灌注引起的离体大鼠心肌收缩功能下降

目的:观察杭白菊水提取液在缺血再灌注和缺氧/复氧过程中对离体心脏和心室肌细胞的影响,并探讨其作用机制。方法:采用Langendorff离体灌流心脏模型,观察心室收缩功能;用视频跟踪系统和细胞内双波长荧光系统分别记录单个心肌细胞收缩和i;测定心肌丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果:杭白菊(0.5g/L)可明显减轻缺血再灌注引起的离体灌流心脏左室发展压、最大收缩/舒张速率、冠脉流量和左室发展压与心率乘积的抑制作用;并明显减弱缺氧/复氧抑制心室肌细胞收缩幅度、最大收缩/舒张速度和细胞钙瞬态的作用。杭白菊处理的缺血再灌注组心肌SOD水平明显升高,MDA含量显著降低。结论:杭白菊可能通过对抗自由基的作用,从而减轻缺血再灌注和缺氧/复氧对心肌收缩功能的抑制。     

应用激光共聚焦显微镜对细胞粘附分子-1在人脐静脉内皮细胞上的定位研究

细胞粘附分子-1广泛分布于人体各种血管内皮细胞,包括人脐静脉内皮细胞。普通免疫组化只能显示人脐静脉内皮细胞上有细胞粘附分子-1的存在,而激光共聚焦显微镜可对细胞粘附分子-1在人脐静脉内皮细胞的分布进行立体定位。方法:取培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV304)细胞,免疫组化采用DAB显色,用于激光共聚焦显微镜观察的标本采用免疫荧光染色。结果:免疫组化染色见ECV304细胞呈单层排列,细胞被染成基本均一的棕黄色,不能确定细胞粘附分子-1的定位。采用激光共聚焦显微镜对免疫荧光染色的标本进行分层扫描三维重建后,结果见单层排列的ECV30…     

AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱研究

目的 :探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱。方法 :体外培养人脐静脉内皮细胞株 (ECV3 0 4) ,实验分AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。采用改良MTT法、Fen ton反应和硝酸酶还原法分别观察不同浓度AngⅡ在4h、1 2h和 2 4h时对ECV3 0 4细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH和NO)的量。应用基因芯片技术和光镜分别检测 0 .0 62 5和 1 μmol/LAngⅡ作用 1 2h时ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。结果 :实验结果发现 :①一定浓度的AngⅡ(0 .0 3 1 2 5～ 1 μmol/L)作用 1 2h时E…     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

降钙素基因相关肽对培养的血管内皮细胞缺氧再给氧的影响

目的:观察降钙素基因相关肽(CGRP)对培养的人脐静脉血管内皮细胞缺氧再给氧损伤的影响。方法:用培养的人脐静脉血管内皮细胞建立缺氧再给氧模型,观察血管内皮细胞在缺氧再给氧状态下台盼兰摄取率、细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性,钙、镁含量和丙二醛(MDA)含量的变化以及CGRP对培养的血管内皮细胞的影响。结果:1×10^-8mol/LCGRP可降低缺氧再给氧时血管内皮细胞的台盼兰摄取率、钙含量及MDA含量,降低LDH活性,减少细胞内镁的丢失。结论:CGRP对缺氧再给氧的血管内皮细胞具有直接保护作用,其作用可能与CGRP具有抗脂质过氧化,减轻细胞内钙超载以及减少镁与酶的丢失有关。     

P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达P-选择素中的作用

目的 :研究P38信号通路 (P38mitogen activatedproteinki nase ,P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞表达P 选择素以及糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法 :分别以高葡萄糖、糖基化终产物 (AGE)、高胰岛素和过氧化氢刺激人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4 ,再以P38MAPK特异性抑制剂SB2 0 35 80预处理 ,观察ECV 30 4细胞系中磷酸化P38MAPK和P 选择素的表达。结果 :4种刺激因素均可单独激活P38MAPK ,使磷酸化P38MAPK表达量明显增加 ,P 选择素表达量也明显增加 ;以SB2 0 35 80预处理后 ,P 选择素的表达被明显抑制。结论 :P38MAPK是P 选择素的上游信号分子 ,也可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一     

高胆固醇上调Caveolin-1的表达

为了研究高胆固醇血症对血管内皮细胞膜上 Caveolin- 1表达的影响。用免疫组织化学的方法检测了高胆固醇血清刺激的培养人脐静脉内皮细胞株 ECV- 30 4细胞以及高脂血症大鼠动脉内皮上 Caveolin- 1表达量的动态变化。发现高胆固醇可上调体内外内皮细胞膜上 Caveolin- 1的表达。在高血脂模型初期 ,Caveolin- 1的表达量与高血脂水平的维持时程成正相关 ;在高胆固醇血症模型后期 ,血管内皮细胞膜上 Caveolin- 1的表达略有下降     

抗人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体的制备

目的 制备人血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(Kinase insert domain tontaining receptor,KDR)胞外Ⅲ区的单克隆抗体(McAb)，探讨其抑制VEGF诱导的体外活性。方法 在大肠杆菌中表达重组KDR胞外Ⅲ区融合蛋白。融合蛋白经抗E—tag柱分离纯化后免疫Balb/c小鼠，采用传统杂交瘤技术制备抗KDR胞外Ⅲ区McAb，采用ELISA和Western免疫印迹鉴定其亚类和抗原结合特异性，并测定单克隆抗体对VEGF165刺激脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的中和活性。结果 成功筛选出一株能稳定分泌KDR胞外Ⅲ区单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1D3)，其分泌抗体亚类为IgGl。该McAb可明显阻断VEGF165对脐静脉内皮细胞株ECV304的刺激增生作用。结论 抗人血管内皮细胞生长因子受体KDR胞外Ⅲ区McAb可通过封闭KDR而抑制VEGF活性，McAb 1D3具有潜在治疗肿瘤的活性。     

低糖诱导人脐静脉内皮细胞一氧化氮与活性氧变化的研究

目的观察低浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞一氧化氮（NO）与活性氧（ROS）变化的影响。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12为研究对象,将实验分为正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖）、低糖组（2.8mmol/L葡萄糖）、无糖组（0mmol/L葡萄糖）。分别用2.8、0mmol/L葡萄糖干预HUVEC-12细胞,经过1、2、4、12h后,硝酸还原酶法测定NO产量,化学比色法测定一氧化氮合成酶（NOS）活性,Dihydroethidium荧光探针法测定细胞内ROS水平。结果与正常对照组相比,低糖组与无糖组NO水平降低（P〈0.01）,NOS活性下降（P〈0.01）,细胞内ROS水平升高（P〈0.01）,均呈剂量依赖关系。同一浓度组内随着时间的延长,内皮细胞NO水平、NOS活性进一步降低（P〈0.01）,ROS水平进一步升高（P〈0.05）,各指标都具有浓度和时间依赖性。结论低糖可导致内皮细胞功能障碍,NO水平降低,NOS活性下降,其机制可能与低糖导致内皮细胞氧化应激损伤有关。     

人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗细胞模型的建立

背景：有研究表明血管内皮可能是胰岛素抵抗发生的首要环节。 目的：采用高浓度胰岛素体外诱导培养法建立人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗模型。 方法：以人脐静脉内皮细胞系为研究对象,应用含不同浓度胰岛素(50,40,30,20,10,1,0.1,0.01 U/L)的DMEM培养基与人脐静脉内皮细胞共同培养12,24,36,48,72 h,并设置正常组,光学显微镜下观察细胞形态学变化;MTT法测定各组细胞活性;用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法法鉴定胰岛素抵抗细胞模型。 结果与结论：与正常组比较,当胰岛素浓度大于40 U/L,其作用时间大于48 h时,细胞形态受损严重,细胞活性显著下降(P < 0.01);当胰岛素浓度小于20 U/L,作用时间小于36 h时细胞形态无明显损伤(P > 0.05)。葡萄糖氧化 酶-过氧化物酶法实验表明,在30 U/L的胰岛素刺激48 h条件下,培养液中残存葡萄糖浓度显著高于正常组细胞 (P < 0.01)。证实,用含30 U/L胰岛素的培养基培养48 h的人脐静脉内皮细胞细胞可产生胰岛素抵抗。     

肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响

目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达细胞克隆,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、免疫细胞化学方法检测鉴定重组质粒的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定表达细胞中HGF的含量;再以MTT法检测转染重组质粒后细胞增殖的改变,Transwell Migration实验检测细胞迁移能力的改变。结果:所构建重组质粒经酶切图谱分析和序列测定证实构建成功;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR证实HGFmRNA在转染阳性细胞高表达;免疫细胞化学证实转染pEGFP-HGF质粒的细胞有HGF蛋白的表达;ELISA检测细胞培养基中HGF含量可达112.3 ng/ml,MTT法、TranswellMigration测定转染pEGFP-HGF阳性细胞的增殖、迁移能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:重组质粒pEGFP-HGF能够在内皮细胞株ECV304转录、表达;表达的活性蛋白HGF刺激ECV304的增殖、迁移,为进一步应用于基因治疗奠定实验基础。     

当归对高糖所致内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究高糖培养液对体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304的影响及当归注射液对高糖培养环境中内皮细胞功能的保护作用。方法:在RPMI1640培养液中培养内皮细胞后,分成对照组、高糖培养组、高糖+当归组、当归组,培养48h后观察各组内皮细胞形态、检测培养液中一氧化氮(NO)浓度和ECV304细胞增殖活性。结果:高糖培养ECV304细胞有肿胀现象,且数量减少;当归干预后,ECV304细胞形态与对照组相似,且数量增多。高糖培养的ECV304细胞增殖活性和NO浓度较高糖+当归组显著减少(P<0.05),而当归组与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论:当归注射液可以预防高糖培养对内皮细胞增殖及分泌NO功能的损害,从而对糖尿病患者的血管损害可能起到一定的保护作用。     

血管紧张素Ⅱ促进内皮细胞凋亡和NOX4表达

目的分析高浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)时细胞内活性氧(ROS)、NOX4 mRNA水平和细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫组化法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;RT-PCR检测HUVECs中NOX4的表达;流式细胞仪检测各组细胞内ROS生成量和细胞凋亡率,Hoechst染色分析细胞凋亡。结果高AngⅡ刺激HUVECs时,NOX4 mRNA表达上调,细胞内ROS生成增加,细胞凋亡增加。结论高AngⅡ上调HUVCEs内NOX4mR-NA表达并促进细胞内ROS生成和细胞凋亡。     

甲状旁腺切除对大鼠离体心脏缺血性挛缩及再灌注冠脉流量的影响

本实验将大鼠双侧甲状旁腺切除,观察其对大鼠离体心脏缺血性挛缩及再灌注冠脉流量的影响。材料与方法Wistar雄性大鼠60只,体重220～280g,随机分成对照组及实验组,每组30只。对照组行假手术,实验组切除双侧甲状旁腺。常规切片及术后三周时血浆钙明显降低(<1.75mmol/L)作为手术成功的指标。术后三周时将大鼠心脏取出,1分钟内以Langendo-     

阿魏酸钠对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞NOS基因表达的影响

目的 :探讨阿魏酸钠 (SF)在人脐静脉内皮细胞中对内皮型一氧化氮合酶 (ecNOS)和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)基因表达的影响。方法 :常规培养人脐静脉内皮细胞 (ECV3 0 4) ,分成 5组 :①正常对照组 ,常规培养 ;②肿瘤坏死因子 α(TNF α)Ⅰ组 ,培养液中加入TNF α10 0 0u/ml作用 30min ;③TNF αⅡ组 ,培养液中加入TNF α 10 0 0u/ml作用 6h ;④SF +TNF αⅠ组 ,培养液中先加入SF 1mg/ml孵育 1h ,再加入TNF α 10 0 0u/ml作用 30min ;⑤SF +TNF αⅡ组 ,培养液中先加入SF 1mg/ml孵育 1h ,再加入TNF α 10 0 0u/ml作用 6h。采用原位杂交法检测iNOS和ecNOS的mRNA表达 ,扫描电镜观察细胞形态变化。结果 :①TNF α使内皮细胞iNOSmRNA表达增高而ecNOSmRNA表达降低 ;电镜下内皮细胞破坏较明显 ,细胞皱缩 ,微绒毛断裂 ,分布不规则。以上改变又以 6h为著。②将SF与TNF α共同作用于内皮细胞使内皮细胞iNOSmRNA表达下降 ,ecNOSmRNA表达增高 ;电镜下内皮细胞破坏轻微。结论 :TNF α诱导内皮细胞iNOSmRNA表达增高 ,ecNOSmRNA表达抑制。而SF使内皮细胞iNOSmRNA表达下降 ,ecNOSmRNA表达增高 ,这可能是SF抗动脉粥样硬化 ,抗炎症损伤的机理之一     

ECV304细胞株用于体外血管新生的实验研究

血管新生与肿瘤的生长、组织损伤修复等病理生理过程密切相关而备受关注。体外血管新生模型有助于研究某种因素对血管形成的影响而成为常用的研究手段。体外血管新生研究中,由于原代培养的人脐静脉内皮细胞增殖活性低、传代次数少,因而多采用细胞株作为内皮材料。ECV304细胞是自发转化的人脐静脉内皮细胞株,但是Ⅷ因子相关抗原为阴性,因此部分学者对ECV304的应用产生质疑。本研究采用ECV304细胞构建体外血管新生二维、三维模型,对其可行性进行探讨。     

聚己内酯和β-磷酸三钙复合支架经血小板衍生生长因子BB修饰后的促血管生成作用

背景：组织工程技术的发展为骨缺损的修复重建提供了新的思路,但是血管化问题使组织工程骨应用于临床受到了制约。血小板衍生生长因子在促进骨细胞形成的同时也可促进骨组织中血管的形成。目的：观察聚己内酯/β-磷酸三钙/血小板衍生生长因子BB支架对骨髓间充质干细胞成骨分化及人脐静脉内皮细胞增殖、黏附的影响,以及修复骨缺损的效果。方法：(1)利用3D快速成形机制备聚己内酯/β-磷酸三钙支架(记为PCL/β-TCP支架),将支架浸渍于血小板衍生生长因子BB溶液中制备聚己内酯/β-磷酸三钙/血小板衍生生长因子BB支架(记为PCL/β-TCP/PDGF BB支架)。(2)体外实验：将骨髓间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞分别接种于两种支架上,检测骨髓间充质干细胞的成骨分化情况,检测人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附与成血管基因表达。(3)体内实验：取21只成年大鼠,建立双侧胫骨缺损模型,实验组植入PCL/β-TCP/PDGF BB支架,对照组植入PCL/β-TCP支架,空白组不植入支架,每组7只。术后12周,进行Micro-CT扫描、骨组织形态学观察及成骨与成血管基因检测。结果与结论：(1)体外实验：与PCL/β-...     

丁苯酞减轻H2O2诱导的人脐静脉和脐动脉内皮细胞氧化损伤

目的探讨丁苯酞(NBP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的血管内皮细胞(人脐静脉和脐动脉)氧化损伤的保护作用及发生机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脐动脉内皮细胞(HUAECs)。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选合适的H_2O_2剂量建立两种细胞的氧化应激损伤模型。在加入H_2O_2前2 h,分别用两种剂量的丁苯酞(5和10μmol/L)预孵育细胞,用MTT法检测细胞活力,罗丹明123检测线粒体膜电位,Annexin V/PI双染法检测凋亡细胞,Fura-4/AM检测细胞内游离钙。结果 H_2O_2刺激可导致HUVECs和HUAECs细胞活力下降,线粒体膜电位下降,细胞内游离钙增多,细胞凋亡率上升(P0.05)。丁苯酞可改善H_2O_2诱导的上述变化。结论丁苯酞可通过减轻H_2O_2造成的氧化损伤来保护血管内皮细胞。     

脂肪间充质干细胞来源外泌体miR-126-3p对人脐静脉内皮细胞糖脂毒性的作用

背景:脂肪间充质干细胞衍生外泌体(adipose-derived mesenchymal stem cells released exosomes,AMSC-Exos)中miR-126-3p可作为糖尿病的一种潜在生物标志物,但其对人脐静脉内皮细胞糖脂毒性的作用及其相关机制研究较少。目的:探究AMSC-Exos中miR-126-3p对人脐静脉内皮细胞糖脂毒性的效用及作用机制。方法:(1)以30 mmol/L葡萄糖与100μmol/L棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞糖脂毒性体外模型;(2)收集第4代脂肪间充质干细胞上清液提取外泌体,透射电镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析外泌体粒径分布范围;(3)AMSC-Exos处理糖脂毒性人脐静脉内皮细胞,流式细胞术检测活性氧水平及细胞凋亡率,ELISA检测培养上清中炎症因子水平;(4)RT-qPCR分析AMSC-Exos、与脂肪间充质干细胞共培养后正常人脐静脉内皮细胞中miR-126-3p mRNA相对表达水平;(5)miR-126-3p转染糖脂毒性人脐静脉内皮细胞,CCK-8检测细胞增殖情况,Western blot检测凋亡蛋白的表达量;(6)生物信息学软件...     

内皮克隆形成细胞旁分泌对人脐静脉内皮细胞生物学功能的影响北大核心

背景:研究表明,内皮克隆形成细胞移植对缺血损伤组织的血管新生具有促进作用。然而,这一作用是否与其旁分泌效应有关,仍有待进一步研究证实。目的:检测人脐血来源内皮克隆形成细胞条件培养基中细胞因子分泌谱,并观察内皮克隆形成细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响。方法:从人脐血中分离、培养内皮克隆形成细胞,并进行细胞鉴定。采用抗体芯片对无血清内皮克隆形成细胞条件培养基中的细胞因子进行检测。采用无血清EBM-2培养基作为对照组,应用CCK-8、细胞划痕实验、Matrigel成管实验检测内皮克隆形成细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响。结果与结论:(1)原代培养细胞形态:培养的细胞呈"铺路石"样生长,表达CD34,KDR及CD144,不表达CD45及CD133,Dil-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双阳性,在Matrigel基质胶中可形成管腔样结构,以上均符合内皮克隆形成细胞的特征;(2)抗体芯片检测:内皮克隆形成细胞条件培养基高表达30种促血管新生因子;(3)CCK-8检测:实验组人脐静脉内皮细胞在24,48,72 h增殖活性均高于对照组(P<0.01);(4)细胞划痕实验结果显示,实验组人脐静脉内皮细胞迁移率在12,24 h均高于对照组(P<0.01);(5)与对照组相比,实验组人脐静脉内皮细胞在Matrigel基质胶上可形成更多的管状结构(P<0.01)。(6)结果表明:内皮克隆形成细胞能通过旁分泌效应促进成熟内皮细胞的生物活性。