卡介苗增强人肺腺上皮细胞β-防御素-1基因的转录

目的 :检测卡介苗 (BCG)胞壁蛋白对人 β -防御素 - 1(hBD - 1)基因表达的影响 ,并初步分析该基因 5′ -端旁侧区中的BCG作用元件。方法 :经SephadexG - 15 0层析柱分离得到BCG细胞壁蛋白组份。用逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)和North ern杂交分析法检测hBD - 1mRNA在肺腺上皮细胞的表达。一系列逐渐缩短的hBD - 1基因 5′-端序列被连接入无启动子的pCATBasic质粒 ,构建了CAT报告质粒。ELISA法检测报告基因表达。结果 :热灭活的BCG全菌 (5 0mg/L)及分子量在 18- 30kD的胞壁蛋白组份 (3mg/L)刺激SPC -A - 1细胞 8h后 ,hB…     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β -防御素 - 2基因的激活作用及其活性组分。 方法 :应用逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)法和Northern杂交检测HT - 2 9细胞hBD - 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT -PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT - 2 9细胞无可见的hBD - 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD - 2mRNA表达。结论 :双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD - 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用…     

卡介苗增强人肺腺上皮细胞β-防御素-1基因的转录

目的 :检测卡介苗 (BCG)胞壁蛋白对人 β 防御素 1 (hBD 1 )基因表达的影响 ,并初步分析该基因 5′ 端旁侧区中的BCG作用元件。方法 :经SephadexG 1 5 0层析柱分离得到BCG细胞壁蛋白组份。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)和Northern杂交分析法检测hBD 1mRNA在肺腺上皮细胞的表达。一系列逐渐缩短的hBD 1基因 5′ 端序列被连接入无启动子的pCATBasic质粒 ,构建了CAT报告质粒。ELISA法检测报告基因表达。结果 :热灭活的BCG全菌( 5 0mg/L)及分子量在 1 8kDa～ 30kDa的胞壁蛋白组份 ( 3mg/L)刺激SPC A 1细胞 8h后 ,hB…     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

卡介苗增强人肺腺上皮细胞Fall-39 mRNA表达及其抗菌活性

目的Fall-39是Cathelicidine家庭中唯一存在人体内的抗菌肽,具有广谱抗菌活性和细胞毒性,对天然免疫与获得性免疫均发挥作用,因此在抗生素肽开发领域日益受到重视,本研究观察卡介苗能否增强人肺腺上皮细胞表达Fall-39.方法根据GenBank中人Fall-39的cDNA序列资料,设计特异性引物,应用RT-PCR的方法检测mRNA的表达.超声击粹、蔗糖密度梯度离心及SDS抽提等步聚提取卡介苗胞膜蛋白,SephadexG-75柱层析粗分其不同分子量蛋白.结果卡介苗的确可刺激人肺腺上皮细胞Fall-39mRNA的增强表达,这种增强表达具刺激物剂量和时间依赖性.BCG100mg/L刺激8h时,Fall-39mRNA表达量达到最高.BCG胞壁蛋白经SephadexG-75柱层析,获得的组分4(分子量范围约2.1-2.9kD)刺激SPC-A-1细胞后Fall-39mRNA的表达增强了8.5倍.培养细胞上清抗菌试验显示被刺激细胞培养上清的抗菌活性亦明显增强.结论结果提示除细菌LPS外,BCG胞壁蛋白亦是Fall-39基因的激活因子,可诱导其基因的上调表达.     

卡介苗胞壁蛋白诱导人肺腺上皮细胞hBD-1 mRNA表达及其抗菌活性的增强

目的旨在分离和鉴定刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)β-防御素-1(hBD-1)基因表达的卡介苗胞壁活性蛋白,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础.方法采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Northern杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性.结果RT-PCR和Northern杂交分析均证实卡介苗刺激SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达增强了2倍.卡介苗胞壁蛋白SephadexG-150层析所得6个组分中,组分5(分子量范围约21×104-29×104)诱导SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达增强4倍,其培养上清的抗菌活性显著增强.这种诱导作用具剂量和时间依赖关系.结论结果提示卡介苗胞壁蛋白是β-防御素基因诱导表达的一新的激活因子.     

人β-防御素-2基因5′-端转录调控区DNA片段的克隆及序列初步分析

人 β-防御素 (hBD)主要由上皮细胞生成 ,包括hBD - 1、hBD - 2等亚类 ,是皮肤、粘膜免疫的重要分子。其中hBD - 2是富含半胱氨酸阳离子的由 4 1个氨基酸组成的低分子抗菌肽。通常hBD - 2在健康组织中为低水平表达 ,但当皮肤、肺、气道组织有病菌入侵时可诱导hBD - 2的大量表达。对牛气道防御素 (TAP)受LPS刺激诱导表达的转录机制的研究表明NF -κB和NF -IL6共同调控TAP基因的转录。本研究将人 β -防御素 - 2基因上游序列输入Matinspector软件 ,应用Matinspector软件于转录因子数据库 (http ://tansfac gbf de/TRANSFAC)中…     

卡介苗胞壁蛋白诱导THP-1细胞IL-12mRNA表达

目的：研究卡介苗(BCG)能否诱导人单核白细胞系细胞THP—1、IL-l2 P40基因表达，并鉴定其胞壁蛋白的活性组份。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)法检测THP—1细胞IL-l2 P40mRNA的表达；采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G—150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份。结果：卡介苗胞壁蛋白Sephadex G—150柱层析所得组分中，分子量范围约21—29kD的组份诱导THP—1细胞IL-12 P40mRNA的表达增强。结论：结果显示BCG胞壁蛋白可刺激白细胞IL-l2 P40基因的表达。     

抗菌肽的基因表达调控研究进展

抗菌肽在宿主抵抗病原微生物感染中起重要作用 ,是天然免疫的重要介质。果蝇抗菌肽受imd基因编码物质通路和TollNF κB通路的调控。人α 防御素主要在中性粒细胞、帕内特 (Paneth )细胞分化过程合成并贮存于胞浆颗粒中 ,于感染时释放。β 防御素主要由上皮细胞生成。LPS、TNF α、IL 1β等炎症介质可诱导人β 防御素hBD 2基因的表达 ,但hBD 1基因对这些刺激因子却不起反应。hBD 2的诱导性表达与其基因调控序列中κB元件有关。     

卡介苗胞壁蛋白诱导人肺腺上皮细胞hBD-1mRNA表达及其抗菌活性的增强

目的分离和鉴定刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)β-防御素-1(hBD-1)基因表达的卡介苗胞壁活性蛋白,开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂为防治粘膜感染的研究打基础。方法采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组分;应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Northern杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性。结果利用RT-PCR和Northern杂交分析,证实卡介苗刺激SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达增强了2倍。卡介苗胞壁蛋白SephadexG-150层析所得6个组分中,组分5［相对分子质量（Mr）范围在21×103～29×103］诱导SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达增强4倍,其培养上清的抗菌活性显著增强。这种诱导作用具剂量和时间依赖关系。结论卡介苗能增强人肺腺上皮SPC-A-1细胞hBD-1mRNA的表达及其抗菌活性;Mr为21×103～29×103的胞壁蛋白组分起这种刺激作用。     

过表达SOX2对BCG诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞中TLR4/TBK-1/IRF3信号炎性反应的影响

目的探讨SOX2对肺泡Ⅱ型上皮细胞感染结核分枝杆菌后炎性反应的调控作用。方法利用过表达SOX2慢病毒感染肺泡上皮A549细胞系,嘌呤霉素筛选建立稳定过表达SOX2的A549细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测过表达SOX2细胞系的功能,Western blot和ELISA方法检测SOX2在肺泡Ⅱ型上皮细胞感染结核分枝杆菌后炎性相关蛋白及炎性因子的表达。结果成功构建过表达SOX2稳转细胞系,细胞中SOX2基因和蛋白均高表达(P0.01)。用Western blot检测TLR4信号通路相关蛋白表达情况,过表达SOX2组与对照组(NC)相比较,TLR4、TRAF3、TBK-1和IRF-3蛋白表达均上调且差异极显著(P0.01)。BCG刺激下,TLR4/TBK-1/IRF3相关蛋白均高表达,过表达SOX2减弱了BCG诱导的TLR4/TBK-1/IRF3相关蛋白的高表达,炎症因子IL-6和TNF-α亦表现出相同趋势。结论过表达SOX2能够减弱BCG诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症反应。     

IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用研究

为探讨年龄相关性黄斑变性的免疫炎症反应机制,采用real-time PCR及ELISA检测β-淀粉样蛋白1-40(Aβ_((1-40)))刺激RPE细胞后IL-33 mRNA及蛋白水平表达,并采用ELISA检测IL-33刺激RPE细胞后炎症因子表达情况及调控产生炎症因子的信号通路。结果发现,Aβ_((1-40))刺激人视网膜色素上皮细胞后能够诱导IL-33因子转录及蛋白水平表达上调,且在人视网膜色素上皮细胞中,IL-33因子分别通过p38 MAPK、ERK1/2信号通路调控促炎症因子IL-6、IL-8的表达。据此说明,IL-33通过调控人视网膜色素上皮细胞产生促炎症因子IL-6、IL-8参与年龄相关性黄斑变性的发生发展。     

SARS-CoV的S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10的信号分子机制研究

目的：研究SARS冠状病毒S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10（interferon-gamma inducible protein 10）的信号分子机制。方法：通过基因芯片检测SARS冠状病毒的S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE后信号通路基因表达谱的变化；采纳RT-PCR、EMSA、Western blotting等方法进一步分析JAK-STAT通路中信号分子的磷酸化、IRF-1和IP-10基因表达的变化及其相应信号分子抑制剂对表达水平的影响。结果：S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE诱导了JAK-STAT信号通路涉及的重要转录因子基因IRF-1的表达，该信号通路的转录因子STAT1在刺激后15 min发生磷酸化，2 h即可检出IP-10基因的表达， IP-10的表达可以完全被STAT1、JAK2抑制剂阻断。EMSA显示：支气管上皮细胞在S蛋白的作用下，其核蛋白能够特异性与ISRE和GAS DNA基序相结合，而不能与NF-κB的 DNA基序相结合。结论： SARS－CoV的S蛋白通过激活JAK-STAT信号转导通路诱导IP-10在宿主细胞的生成。提示病毒诱导的JAK-STAT信号通路激活在病毒感染相关的急性肺损伤发生中具有重要地位。     

SIGIRR过表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB的活化

目的: 研究单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对脂多糖(LPS)刺激的肺泡上皮细胞核因子-κB信号通路的调节作用。方法: 以LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549。将含有SIGIRR cDNA 全长的真核表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。用双萤光素酶报告系统检测LPS刺激后A549细胞NF-κB的转录活性,用ELISA法检测LPS刺激后细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水平,对比转染与否对上述因子在A549细胞中释放水平的影响。结果: 在A549细胞中,过表达SIGIRR可显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达。 结论: SIGIRR过表达可以抑制LPS触发的肺泡上皮细胞中TLR4信号的转导,从而发挥减轻炎症反应、保护肺泡上皮细胞的作用。     

脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱分析

目的　利用基因芯片技术分析脂多糖 (LPS)活化的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱 ,以更全面地了解LPS诱导的巨噬细胞反应。方法　以未刺激的和用 1mg/LLPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞制备3 3 P标记的cDNA探针 ,分别与含有 1176个已知基因的小鼠cDNA芯片杂交。结果　活化组和未刺激组间的 2倍差异表达基因为 118个 ,3倍差异表达基因为 6 9个 ,其中 4 4个上调 ,2 5个下调。转录因子、细胞内信号调节蛋白、炎症细胞因子和细胞凋亡相关基因的转录发生明显的调节变化。结论提供了LPS活化的巨噬细胞综合基因表达信息 ,并筛选出一些新的可能与LPS活化相关的基因。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β- 防御素-2基因表达及其信号转导机制

目的：本项研究目的是检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分，进一步探讨其受体及其胞内信号传导通路。方法：厌氧培养长双歧杆菌，采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取方法获得双歧杆菌胞壁蛋白质成份，利用Scphacryl S-100HR分子筛分离细胞壁蛋白。分别利用活菌，热灭活全菌，全细胞壁组份和全细胞壁蛋白组分，刺激人肠腺上皮细胞Caco-2，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法、Northern杂交、免疫细胞化学染色和ELISA等技术在mRNA和肽水平上检测hBD-2基因的表达。应用Western Blotting技术检测到IκB-α磷酸化和降解、NF-κB p65的核移位以及细胞内MAPKs蛋白分子ERKl／2、p38MAPK和JNK的磷酸化。为了进一步检测NF-κB在介导双歧杆菌胞壁蛋白诱导的人肠上皮细胞hBD-2基因表达中的作用，     

自身免疫调节因子在小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化中的表达

文题释义：自身免疫调节因子：基因分析显示由于单基因突变引起一种自身免疫病,此基因则被命名为自身免疫调节因子即AIRE基因。AIRE基因的突变或者缺失会造成胸腺内自身组织特异性抗原转录缺失,影响阴性选择,从而致使自身反应性T细胞逃逸外周,引起自身免疫反应。AIRE基因一直是免疫学相关研究中的热点。胸腺上皮细胞：胸腺上皮细胞分为髓质胸腺上皮细胞和皮质胸腺上皮细胞,二者均来源于胸腺上皮祖细胞,据研究报道髓质胸腺上皮细胞表达的AIRE基因调控着胸腺内的阴性选择,但是由于胸腺上皮祖细胞和胸腺上皮细胞不易分离且数量少,其应用和研究一直受限。该实验在体外将胚胎干细胞分化为胸腺上皮祖细胞,可以为相关研究提供细胞来源。  摘要背景：自身免疫性疾病主要是由于胸腺内自身组织特异性抗原持续表达缺失而引起强烈免疫应答的一类疾病,而胸腺功能减退和胸腺内组织特异性抗原的不稳定表达会限制治疗效果。胸腺组织主要由胸腺上皮细胞组成,但胸腺内成熟胸腺上皮细胞和胸腺上皮祖细胞有限的数量来源极大限制了相关研究。目的：研究小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化过程中自身免疫调节因子的表达变化。方法：采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,分别收集定向诱导分化第0,3,13天细胞,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time PCR 检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论：①诱导分化第0天,免疫荧光检测OCT4、SSEA1表达阳性;诱导分化第3天,免疫荧光检测SOX17、FoxA2呈双阳性表达;诱导分化第13天,流式细胞术检测EpCAM1、K5、K8表达阳性;②Real-time PCR检测小鼠胚胎干细胞定向分化过程中PAX1、PAX9、FOXN1、PLET1基因表达逐渐增高;③Real-time PCR检测分化第0,3,13天AIRE基因表达升高,INS2、GAD67基因表达也升高;④Western blot检测分化第0,3,13天AIRE蛋白表达降低,胰岛素蛋白、GAD67蛋白均无表达;⑤结果表明,小鼠胚胎干细胞成功分化为胸腺上皮祖细胞,且分化而来的胸腺上皮祖细胞中AIRE基因表达很高,促进了INS2、GAD67基因的表达,为细胞移植治疗自身免疫性疾病提供评价依据。ORCID: 0000-0001-5253-3085(胡蓉) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

双岐杆菌胞壁蛋白诱导人肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达及NF-κB的活化

本研究应用超声破碎和离心法分离获得双岐杆菌胞壁，2％SDS提取其胞壁蛋白．superdex-200柱层析获得多个蛋白组分。RT-PCR和Northem杂交检测到双岐杆菌全菌、胞壁、胞蛋白均可诱导人肠上皮细胞株HT-29 and Caco-2细胞表达人β-防御素-2(HBD-2)mRNA的显著表达。为了在蛋白质水平上检测其基因的增强表达。构建了HBD-2基因原核表达载体，并制备获得其重组制品的多克隆抗体，ELISA、     

诱导人肺腺上皮细胞hBD-1基因表达的BCG胞壁蛋白

目的：分离和鉴定增强人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)抗菌活性核β-防御素-1(hBD-1)基因表达的菌种及其有效成份,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础。方法：采用超声波破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性;     

LRRK2/NF-κB信号对BCG诱导巨噬细胞RAW264.7炎症应答的调控

目的:探讨富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用机制。方法:用结核分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)感染巨噬细胞RAW264.7,菌落形成单位(CFU)计数检测结核分枝杆菌生存率;酶联免疫吸附法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)表达水平;q PCR和Western blot法分别检测相关m RNA和蛋白的表达。结果:BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中LRRK2的m RNA和蛋白表达均显著上调,并刺激RAW264.7细胞释放大量细胞因子。此外,沉默LRRK2明显抑制BCG感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率;同时,沉默LRRK2降低BCG刺激诱导分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ。更为重要的是,LRRK2可能通过正调控NF-κB通路调节BCG诱导的炎症应答进程。结论:LRRK2/NF-κB信号正调控BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症应答进程。本研究结果为结核病在基因水平上的诊断和治疗提供了实验依据。