慢性乙肝患者乙肝病毒载量与PBMC凋亡及Caspase-8的相关性研究

目的 探讨慢性乙肝（CHB）患者血清HBVDNA载量与外周血单个核细胞（PBMC）凋亡及Caspase-8活性的关系.方法 选取30例CHB患者为实验组,并按单位血清中HBVDNA载量高低分为A（高病毒载量）、B（中病毒载量）、C（低病毒载量）三小组,选取10例正常成年人为对照组,用淋巴细胞分离液分离两组的PBMC,体外与植物血凝素（PHA）共同培养72 h,用PI对PBMC进行染色并以流式细胞仪检测PBMC的凋亡百分率,同时以比色法检测PBMC细胞内Caspase-8的活性.结果 实验组PBMC的凋亡率（26.88±7.37）%高于健康对照组（14.95±2.53）%（P〈0.01）;实验组中A、B、C三个小组PBMC的凋亡率依次递减,分别为（34.75±4.59）%,（25.63±3.55）%,（18.91±3.81）%;实验组Caspase-8的活性2.99±0.82高于健康对照组1.43±0.91（P〈0.01）,且A、B、C三个小组的Caspase-8活性亦依次递减,分别为3.87±0.35,2.95±0.36,1.95±0.29.实验组PBMC凋亡率与Caspase-8活性呈正相关（r=0.825,P〈0.01）.结论 CHB患者PBMC存在活化诱导细胞死亡（AICD）现象,凋亡酶蛋白Caspase-8在此过程中活性升高,可能参与了凋亡信号的转导过程;HBVDNA载量与PBMC凋亡率及Caspase-8的活性相关,可能是诱发PBMC凋亡的原因之一.     

慢性乙型肝炎患者外周单个核细胞分泌细胞因子的实验研究

目的探讨慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素6(IL-6)水平及与病毒载量的关系。方法采用ELISA法测定60例正常人和138例不同病程慢性乙肝患者PBMC中经植物血凝素(PHA)刺激前后TNF-α、IFNγ-、IL-6在上清液中的表达水平,并用荧光定量PCR法检测PBMC中HBV DNA水平。结果正常对照组及各种慢性乙肝患者PBMC上清液中TNF-α、IFNγ-、IL-6均有表达,HBV感染者三种细胞因子表达水平高于对照组,随着病情程度加重,表达水平逐渐增高(P<0.05);经PHA刺激后对照组及患者组TNFα-、IFN-γ、IL-6水平均有明显增高(P<0.01),但患者组升高水平均低于对照组(P<0.05);随着HBV DNA水平增高,PBMC中TNF-α、IFN-γ表达水平逐渐减低,而IL-6活性逐渐增高(P<0.05)。结论慢性乙肝患者PBMC可分泌TNF-α、IFNγ-、IL-6,其表达水平与宿主病毒载量有关。Th1/Th2细胞因子失衡在PBMC抗病毒免疫受抑,乙型肝炎慢性化进程中起着重要作用。     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞分泌IL-12功能的初步研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染状态下树突状细胞(DCs)的免疫功能。方法运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法,对12例慢性乙型肝炎血清HBV DNA阳性及10例血清HBV DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV DNA进行检测,并比较不同HBV滴度时DCs分泌白细胞介素(IL)-12的功能,同时收集肝炎病毒标志物阴性,肝功能正常的健康志愿者10例作对照。结果 12例血清HBV DNA阳性患者中有7例DCs内可检测到HBV DNA,检出率为58.33%。血清HBV DNA阳性组DCs培养上清IL-12水平明显低于血清HBV DNA阴性组及对照组(均P0.01);而IL-12的表达水平在DCs HBV DNA阳性组明显低于DCs HBV DNA阴性组及对照组(均P0.01)。结论慢性乙型肝炎患者外周血I)Cs亦能受到HBV的感染,感染了HBV的DCs,其IL-12分泌功能明显下降。     

慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞HBV感染后对其细胞免疫功能影响的研究

应用聚合酶链（PCR）方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）病人外周血单个核细胞（PBMC）内乙肝病毒DNA （HBV DNA）。54例PBMC内HBV DNA （+）和71例PBMC内HBV DNA （-）病例平行测定自然杀伤细胞（NK）活性、T细胞亚群比值（CD₄/CD₈）和血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）。结果示慢性乙肝病人PBMC内HBV DNA （+）组NK、CD₄/CD₈和sIL-2R与正常对照组及PBMC内HBV DNA （-）组病人相比差异均有非常显著性（P<0.001）。同时发现慢性乙肝PBMC内HBV DNA （+）病人NK活性、CD₄/CD₈比值和sIL-2R水平有直线相关性（P均<0.01），而PBMC内HBV DNA （-）病人，仅CD₄/CD₈比值和sIL-2R水平呈相关性（P<0.001） NK活性尚未受到明显影响。结果表明，HBV感染PBMC导致慢性乙肝病人细胞免疫功能紊乱，有助于阐明慢性乙肝的发病机制，并有可能为乙肝的防治提供理论依据。     

阿德福韦酯治疗活动性代偿期乙肝肝硬化疗效观察

目的探究阿德福韦酯治疗活动性代偿期乙肝肝硬化的临床疗效。方法将90例活动性代偿期乙肝肝硬化患者随机分为研究组和对照组,每组各45例。研究组在常规治疗的基础上给予阿德福韦酯治疗,对照组在常规治疗的基础上给予拉米夫定治疗,两组患者均连续治疗48周。观察对比两组患者治疗前后肝功能变化及HBV DNA转阴率、治疗总有效率。结果治疗后,两组患者的ALT、AST、A/G及TBIL等肝功能指标均显著改善(P<0.01),且研究组患者的肝功能指标改善程度优于对照组(P<0.01)。研究组患者HBV DNA转阴率和治疗总有效率均显著高于对照组(P<0.05)。结论阿德福韦酯治疗活动性代偿期乙肝肝硬化的临床效果较好,可显著改善肝功能的各项指标,提高HBV DNA转阴率,抑制肝硬化发展,值得临床推广应用。     

慢性乙型肝炎患者血清骨桥蛋白水平与肝功能的相关性

目的 探讨乙型肝炎患者外周血骨桥蛋白(OPN)水平与肝功能的相关性及其临床意义.方法 根据HBV感染血清学标志和HBV DNA的结果分为:A组为HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者;B组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者;C组为正常健康志愿者.用ELISA测血清OPN水平,常规方法测定血清ALT、AST、总胆红素(TBil)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)浓度.结果 乙型肝炎患者OPN水平明显高于对照组(P<0.01),以HBeAg阳性组水平最高,OPN与ALT、AST、TBil呈正相关,与GGT无相关性.结论 OPN可能参与了病毒性肝炎肝脏的炎性损伤过程.     

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异与患者血清病毒载量和标志物及肝功能的关系

目的探讨乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBV BCP)变异与患者血清病毒载量(HBV DNA)和标志物及肝功能的关系。方法采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者血清进行检测BCP区核苷酸(nt)1762A→T和1764G→A联合突变。结果BCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%(P<0.05);BCP变异阳性组的HBV DNA含量显著高于阴性组的含量(P<0.01);BCP变异阳性组HBV DNA含量在HBeAg阳性病例及HBeAg阴性病例中均较BCP变异阴性组高(P<0.01);BCP变异阳性组对肝功能的损害明显高于阴性组(P<0.01)。结论BCP变异可引起HBeAg阴转,病毒复制水平提高;HBV血清标志物联合HBV DNA同步检测,具有重要的临床应用价值;对HBsAg阳性、HBeAg阴性患者需要进一步检测HBV DNA,以免由于基因变异导致将HBeAg阴性者误认为病毒的免疫清除或静息而延误抗病毒治疗时机;BCP变异可使病情加重。     

外周血单核细胞IFN-α和IL-18表达与慢性丙肝患者干扰素应答的关系

目的检测慢性丙肝(CHC)患者外周血单核细胞(PBMC)α干扰素(IFN-α)及白细胞介素18(IL-18)mRNA的表达,探讨慢性丙肝患者细胞免疫功能与干扰素应答的关系。方法聚肌胞(PolyIC)体外刺激正常对照组和慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染组患者PBMC,取培养上清利用病毒保护试验测定IFN-α2b治疗前后病人PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性。同时用脂多糖(LPS)体外刺激不同组PBMC,RT-PCR检测PBMC IL-18 mRNA水平的变化。结果治疗前干扰素治疗应答组患者(n=12)和无应答组患者(n=26)PBMC分泌的干扰素抗病毒生物学活性显著低于正常对照组(n=20)(均P<0.01)。应答组患者PB-MC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,1个月已显著高于无应答组患者(P<0.01);无应答组患者PBMC分泌的干扰素活性始终处于低下水平。治疗前,应答组患者和无应答组患者PBMC IL-18 mRNA水平也显著低于正常对照组(均P<0.01);治疗后,应答组患者IL-18 mRNA水平随治疗时间延长而升高,1个月时显著高于无应答组患者(P<0.01),无应答组患者IL-18 mRNA水平始终较低。PBMC IFN-α活性和IL-18 mRNA水平有良好的正相关性(r=0.873,P<0.01)。结论慢性HCV感染无应答组的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α和IL-18,而应答组经干扰素治疗后表达能力逐渐恢复。慢性丙肝患者PBMC IFN-α活性和IL-18 mRNA水平检测可以作为干扰素治疗预后的判断指标。     

慢性乙型肝炎患者肝脏组织TOLL样受体4的变化和意义

目的 通过检测慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织Toll样受体4(TLR4)的表达变化及其与肝脏病理、临床分度、血清HBV DNA对数值等的关系,探讨TLR4在CHB的意义.方法 采用Elivision二步免疫组织化学方法 检测75例CHB及10例健康对照组肝组织TLR4的表达并予以评分,然后与肝脏病理炎症分级及纤维化分期、临床分度和血清HBV DNA对数值[Lg(血清HBVDNA)]等进行相关性分析.结果健康对照组肝组织无或仅有少量TLR4的表达,CHB组肝组织TLR4的表达明显增强并显著高于健康对照组;在轻、中和重度慢性乙型肝炎患者肝组织TLR4表达强度记分分别为(1.0±0.5),(2.3±0.5)和(2.9±0.4)分,随着临床分度的增加,CHB肝组织上的TLR4表达逐步显著升高(F=104.8,P<0.01,两两间比较均P<0.05),肝组织免疫组化染色强度与临床分度间呈正相关(r=0.838,P<0.01);TLR4的表达强度与肝组织炎症活动度分级(G)呈正相关(r=0.579,P<0.05);但与Lg(血清HBV DNA)以及肝组织纤维化分期(S)均无相关.结论 CHB患者肝细胞TLR4表达上调,TLR4可能与CHB的发病有关.     

恩替卡韦治疗33例慢性乙型肝炎疗效分析

目的 探讨恩替卡韦对33例乙型肝炎(乙肝)的治疗效果.方法 应用恩替卡韦0.5 mg/d口服治疗33例乙肝患者,其中慢性携带者7例,慢性轻度患者12例,慢性中度患者14例.主要检测血清HBV DNA水平,与基线值相比的平均下降量,HBV DNA阴转率(<3log10拷贝/ml);并同时检测ALT、AST复常率.结果 三组患者HBV DNA水平随治疗时间延长呈进行性下降,与基线相比的平均下降量也相应逐渐增加,三组两两比较差异无统计学意义.治疗24周后,携带者HBV DNA阴转率为57.1%,轻度患者为75.0%,中度患者为100.0%.其中,中度患者在治疗至12周、24周、36周时,HBV DNA阴转率显著高于携带者(P<0.05),仅在12周时HBV DNA阴转率高于轻度患者(P<0.01).中度患者48周时有5例达血清转换(35.7%),轻度患者在48周时有4例达血清转换(33.3%).轻度、中度患者分别在36周、24周时ALT/AST完全复常.结论 恩替卡韦治疗乙肝有较高疗效,安全,耐药风险低,值得推广.     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中凋亡分子表达水平及临床意义

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）中凋亡分子表达水平及临床意义。方法 以2018年1月至2020年7月郑州市某医院消化内科诊治的CHB患者为研究对象,比较不同病情程度患者PBMC中凋亡分子（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8）mRNA表达量、辅助T细胞（Th）1细胞因子[白细胞介素（IL）-2、干扰素γ（IFN-γ）]、Th2细胞因子（IL-4、IL-10）水平,采用Pearson相关性分析凋亡分子与IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4的相关性。根据凋亡分子表达均数分为低表达者、高表达者,比较不同表达CHB患者HBV-DNA载量,并分析凋亡分子与乙型肝炎病毒（HBV）-DNA的关系。结果 本研究共纳入CHB患者116例,男83例,占71.6%。患者年龄27~78岁,以45~59岁所占比例最大,占50.9%。轻、中、重度患者分别为36、45、35例,分别占31.0%、38.8%、30.1%。不同病情程度的CHB患者PBMC中Caspase-3 mRNA、Caspase-6 mRNA、Caspase-8 mRNA表达量差异均有统计学意义（均P<0.01）。重度患者IL-2、IFN-γ、IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4低于中度、轻度患者,IL-4、IL-10高于中度、轻度患者（均P<0.01）。以HBV-DNA载量1× 10⁵ copy/mL为界分为高载量与低载量,HBV-DNA高载量患者PBMC中Caspase-3 mRNA、Caspase-6 mRNA、Caspase-8 mRNA表达量高于HBV-DNA低载量患者（P<0.01）;且3者mRNA与IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4呈负相关（P<0.05）,与HBV-DNA载量呈正相关（P<0.05）。结论 PBMC中凋亡分子（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8）mRNA表达随CHB患者病情加重而升高,并与Th1/Th2失衡及HBV-DNA载量具有相关性,抑制凋亡分子表达可为Th1/Th2失衡的纠正及控制HBV的复制提供新思路。     

酶联免疫斑点法检测乙型肝炎病毒感染者抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞

目的 通过观察乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生γ干扰素(IFN-γ)的能力,分析不同类型HBV感染人群特异性CTL免疫应答差异.方法 合成4条人类白细胞抗原(HLA)-A2限制性HBV特异性CTL抗原表位肽[分别为多聚酶P的575-583序列FLLSLGIHL(Tp),HBsAg28-39序列IPQSLDSWVCTSL(Tel),HBsAg183-191序列FLLTRILTI(Te2)和HBcAg18-27序列FLPSDFFPSV(Tc)].流式细胞术鉴定HLA基因表型.用合成的CTL表位肽分别刺激慢性乙型肝炎组(CHB)、慢性乙型重型肝炎组(CSH),既往HBV感染者(N1)组和健康献血员(N2)的PBMC,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测分泌IFN-γ的CTL细胞的频率.结果 (1)HLA-A2基因分布频率:44例CHB组为45.5%(20/44),18例CSH组为55.6%(10/18),10例N1组为60%(6/10),10例N2组全部选择以往研究已确定的HLA-A2阳性者.(2)ELISPOT检测结果:①4条HBV特异性抗原多肽反应阳性率在CHB组、CSH组、N1组和N2组分别为50%(10/20)、10%(1/10)、83.3%(5/6)和10%(1/10).N1组反应阳性率高于CSH组(X2=9.000,P=0.008)和N2组(X2=9.000,P=0.008).②各组对Tp、Te1、Te2和Tc四条肽的平均反应强度用斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示,采用非参数秩和检验,N1组对Tp、Te1、Te2和Tc肽的平均反应强度大于CSH组和N2组(分别为77 SFC/106PBMC vs 10 SFC/106PBMC vs 15 SFC/106PBMC,59 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC,100 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC vs 22 SFC/106 PBMC和57 SFC/106 PBMC vs 20 SFC/106 PBMC vs 30 SFC/106 PBMC,均P<0.01).结论 各种类型HBV感染者不论病毒清除与否,都可对HBV特异性多肽产生T细胞免疫反应,这种免疫反应以既往感染者最强,慢性乙型肝炎组较弱,慢性乙型重型肝炎组缺乏,提示HBV特异性CTL应答可能是自身免疫机制清除病毒的重要因素.     

慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞HBV感染后对其细胞免疫功能影响的研究

应用聚合酶链（PCR）方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）病人外周血单个核细胞（PBMC）内乙肝病毒DNA（HBVDNA）。54例PBMC内HBVDNA（＋）和71例PBMC内HBVDNA（－）病例平行测定自然杀伤细胞（NK）活性、T细胞亚群比值（CD4／CD8）和血清可溶性白细胞介素2受体（sIL－2R）。结果示慢性乙肝病人PBMC内HBVDNA（＋）组NK、CD4／CD8和sIL－2R与正常对照组及PBMC内HBVDNA（－）组病人相比差异均有非常显著性（P＜0．001）。同时发现慢性乙肝PBMC内HBVDNA（＋）病人NK活性、CD4／CD8比值和sIL－2R水平有直线相关性（P均＜0．01），而PBMC内HBVDNA（－）病人，仅CD4／Cd8比值和sIL—2R水平呈相关性（P＜0．001）NK活性尚未受到明显影响。结果表明，HBV感染PBMC导致慢性乙肝病人细胞免疫功能紊乱，有助于阐明慢性乙肝的发病机制，并有可能为乙肝的防治提供理论依据。     

荧光定量PCR检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞乙肝病毒 DNA

目的探讨定量检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的临床意义.方法采用荧光定量PCR检测PBMC及血清中HBV-DNA含量.结果 49例慢性乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA阳性率分别为44.9%(22/49),51.0%(25/49),两者阳性率无统计学意义的差异(P＞0.05),具有一致性;血清HBV-DNA高水平组PBMC的HBV-DNA含量与低水平组比较,两者有统计学意义差异(P＜0.01);血清HBV- DNA高水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(100%)与血清低水平组PBMC的HBV-DNA阳性率(42.9%)比较,两者有统计学意义的差异(P＜0.05);在24例血清HBV-DNA阴性患者中,发现5例PBMC HBV-DNA阳性.结论 PBMC的HBV-DNA检测可反映病毒在体内的复制程度,是对慢乙肝患者血清HBV-DNA检测有意义的补充,有助于临床上对慢乙肝患者血清病毒复制状态的了解及指导治疗用药.     

程序性坏死阻断剂对铝致神经细胞凋亡的影响及其机制

目的 了解程序性坏死阻断剂necrostatin(Nee-1)对铝诱导的神经细胞凋亡的影响,并探讨Nec-1对Caspases凋亡通路的作用机制.方法 用4 mmol/L铝染毒神经母细胞瘤细胞株(SH-SYSY)制备铝致神经细胞死亡模型,在不同浓度铝和(或)Nec-1作用下检测细胞活力的变化,用Heochst 33342/碘丙啶(PI)双染法观察细胞的凋亡和坏死现象,Annexin V/PI双染法定量细胞的凋亡率和坏死率.用Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活力的变化检测凋亡通路,用免疫细胞化学法检测核转录因子(NF-κB)和细胞色素c(Cyt-c)蛋白表达的变化.结果 随着铝染毒剂量的加大,细胞活力明显下降;但加入60 μmol/L Nec-1后,细胞活力明显增强.差异有统计学意义(P<0.05). Nec-1浓度的提高使细胞活力明显上升,表现了明显的促进神经细胞生长、抑制细胞死亡的作用.凋亡和坏死的荧光显微镜观察及流式细胞术定量检测结果 表明,随着铝染毒剂量的增加,神经细胞的凋亡率与坏死率明显上升,但在0～90μmol/L Nec-1作用下,Nec-1浓度越高,细胞的坏死率降低越明显,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01).同时,虽然Nec-1是程序性坏死的阻断剂,但其对凋亡率也有明显的影响,可以使染铝细胞的凋亡率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).对Nec-1作用后细胞的凋亡相关酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力变化检测结果 表明,Nec-1对Caspase-9活力的影响不明显,且对线粒体通路的凋亡诱导分子Cry-c的作用也不明显;但对Caspase-8活力的影响明显,表现在可以明显降低各染铝细胞的Caspase-8活力,提高NF-κB蛋白表达量和在高剂量染铝细胞中降低Caspase-3的活力.结论 Nec-1可以降低铝诱导的神经细胞凋亡,并通过死亡受体通路Caspase-8上调NF-κB表达,降低细胞凋亡率.     

肝炎患者血清IL-2、sIL-2R水平和病毒含量变化

目的分析各型肝炎患者血清中IL_2s、IL_2R以及与HBV DNA、HCV RNA含量的关系变化。方法肝炎患者血清IL_2采用ELISA法,sIL_2R采用双抗体夹心间接ELISA法,HBV DNA定量和HCV RNA定量均采用荧光定量PCR法。结果急性肝炎、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化和重型乙型肝炎患者血清中IL_2均低于正常对照组(P<0.05)。sIL_2R水平均高于正常对照组(P<0.05),其中以急性肝炎尤为明显(P<0.01)。慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎血清的病毒含量与sIL_2R水平呈正相关(P<0.05),但两组之间的sIL_2R水平无相关性(P>0.05)。结论肝病患者血清IL_2s、IL_2R可作为机体感染肝炎病毒后免疫水平和判断肝细胞受损程度的参考指标。     

慢性乙肝患者CD25及CD2m5RNA表达及临床意义

目的:探讨慢性乙肝患者CD25、CD25 mRNA表达水平及其临床意义。方法:选择249例典型慢性乙肝患者,用生物素-链霉亲和素(BSA)法和Real-tim e PCR法分别检测PHA诱导前后患者PBMC CD25和CD25 mRNA表达水平;用PCR法检测患者HBV-DNA载量。结果:慢性乙肝患者静息态和诱导态CD25、CD25 mRNA表达水平与正常对照组相比均降低,差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。慢性乙肝、肝硬化患者CD25和CD25 mRNA的表达水平不完全相同,但差异无显著性(P>0.05)。结论:乙肝患者存在一定程度的免疫功能低下,CD25、CD25 mRNA表达水平降低,其表达水平与病情活跃程度、病毒复制水平相关。