眼镜蛇毒活性组分抑制内皮细胞生长及其生化机制初探

目的探讨中华眼镜蛇毒活性组分(CCVAF)抑制新生牛肺主动脉血管内皮细胞(BAVEC)生长的作用及其生化机制。方法用MTT法测定CCVAF抑制BAVEC的增殖活性,用伊红-考马斯亮蓝法观察细胞骨架,罗丹明-鬼笔环肽荧光探针F-actin骨架蛋白定位,荧光标记流式细胞法测荧光强度表胞内钙离子浓度[Ca2+]i及分光光度法测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及一氧化氮(NO)的含量。结果CCVAF(0.625~20μg/mL)剂量依赖性地抑制内皮细胞的生长,IC50=2.45μg/mL。CCVAF与BAVEC共同孵育后,引起细胞间连接减少,细胞F-actin分布混乱;细胞上清液中LDH活力及NO的含量及胞内[Ca2+]i分别增加。结论CCVAF抑制BAVEC增殖,可能与CCVAF导致细胞骨架改变,LDH及NO分泌量及胞内Ca2+浓度增加等生化机制有关。     

中华眼镜蛇毒活性组分诱导内皮细胞凋亡

目的观察中华眼镜蛇毒活性组分(China cobra venom active factor,CCVAF)诱导内皮细胞凋亡的作用。方法采用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测CCVAF对牛肺主动脉内皮细胞(bovine arteria pulm onalis vascular endothelialcells,BAVEC)凋亡形态学、DNA、细胞周期以及凋亡指数的影响。结果经AO染色、流式细胞仪分析均证实CCVAF能够诱导内皮细胞出现凋亡。荧光显微镜下观察到CCVAF各浓度(0.15625、0.3125、0.625、1.25μmol.L-1)组处理的内皮细胞,核染色质固缩或断裂成片段状,染色不均匀,出现凋亡小体,凋亡细胞的比例随浓度升高而增加,0.625μmol.L-1组视野内凋亡细胞最多;流式细胞仪分析结果表明CCVAF在浓度低于0.625μmol.L-1,细胞生长被阻滞在S期,1.25μmol.L-1时则被阻滞在G0/G1期,且细胞凋亡率随浓度升高而逐渐增加。结论CCVAF能够诱导内皮细胞出现凋亡,通过此途径抑制内皮细胞的生长增殖,这可能是其对抗血管生成的机制。     

青蒿琥酯对成纤维细胞和内皮细胞的选择性研究

目的:探讨青蒿琥酯(Art)是否对成纤维细胞增殖有特异的细胞选择作用.方法:选用人胚肺成纤维细胞株(HLF)、人皮肤瘢痕成纤维细胞(HSF)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用免疫组化法鉴别细胞;MTT法检测青蒿琥酯对上述3种细胞存活与增殖的影响;光镜观察青蒿琥酯作用下细胞形态学的改变;琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA的变化.结果:青蒿琥酯在30～240 mg·L-1浓度范围内作用细胞 24 h 对两种来源的成纤维细胞的增殖都具有明显的抑制作用(P＜0.05),对血管内皮细胞增殖抑制作用不明显(P＞0.05).药物作用 24 h 后,HLF、HSF、HUVEC细胞的IC50分别为:64、60、600 mg·L-1.光镜下见两种成纤维细胞用药组细胞变圆,突起变短变少,胞浆颗粒增多;而内皮细胞在形态上无明显的变化.琼脂糖凝胶电泳结果显示在240 mg·L-1浓度作用 24 h,两种成纤维细胞的DNA出现梯带状的电泳图谱,而内皮细胞的DNA无梯状条带.结论:青蒿琥酯对来源于肺和皮肤的成纤维细胞的增殖具有抑制作用,而对血管内皮细胞生长增殖无明显的影响.该药还能诱导两种成纤维细胞凋亡,而对脐静脉内皮细胞无明显诱导凋亡的作用.     

多沙唑嗪光学异构体对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的选择性抑制作用

目的观察多沙唑嗪(racemic-doxazosin,rac-DOX)及其对映体(S-DOX、R-DOX)对大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响。方法采用培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,应用MTT比色法,测定VSMCs的增殖活力,Giemsa’s染色观察VSMCs的形态学改变。结果在3~30μmol.L-1浓度范围,S-DOX、R-DOX和rac-DOX作用于VSMCs 96 h,均抑制大鼠胸主动脉VSMCs增殖活动;但是,S-DOX的抑制作用强于同浓度R-DOX(P<0.05),与同浓度rac-DOX的抑制作用无差别。以30μmol.L-1浓度的药物处理VSMCs 48 h、72 h和96 h;S-DOX对主动脉VSMCs增殖的抑制率依次为28.67%、34.51%和56.89%,R-DOX为22.59%、26.66%和45.79%,rac-DOX为21.88%、32.84%和52.04%。以不同浓度的药物处理大鼠胸主动脉VSMCs 96 h,rac-DOX、S-DOX和R-DOX抑制VSMCs增殖达40%的浓度(IC40)分别为(12.1±2.6)、(10.2±1.3)和(20.9±2.2)μmol.L-1;R-DOX的IC40值大于rac-DOX和S-DOX(P<0.01)。S-DOX处理后,VSMCs出现细胞体积变小,核固缩,核边集等形态学改变。结论S-DOX和R-DOX对大鼠胸主动脉VSMCs的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,S-DOX的抗VSMCs增殖作用明显强于R-DOX。     

中华眼镜蛇毒活性组分诱导内皮细胞凋亡的机制

目的通过检测内皮细胞Bcl-2和caspase3的表达水平,探讨中华眼镜蛇毒活性组分(CCVAF)诱导内皮细胞凋亡的可能机制。方法采用血管内消化法原代培养牛肺主动脉血管内皮细胞(BAVEC)。实验分为不同浓度的CCVAF组(1.25,2.5,5,10 mg/L)和对照组(等体积的培养基)。采用流式细胞仪检测CCVAF作用24 h后各组BAVEC的Bcl-2表达水平;采用比色法测定caspase3的活性。结果经CCVAF作用后,流式细胞仪测定各组均未见到有阳性峰出现在M1,抗凋亡蛋白Bcl-2表达并没有受到药物的影响。而与对照组相比,capase3活性在1.25mg/L组即出现升高,此后随浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(r=0.929,P<0.05)。各浓度组加入capase3活性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)后,capase3活性明显降低,但仍然高于对照组(P<0.05)。结论 CCVAF不影响内皮细胞Bcl-2的表达,而能够上调capase3的活性。其可能不经Bcl-2影响的线粒体所在的凋亡通路调节细胞的凋亡。     

中华眼镜蛇毒活性组分抑制微血管形成研究

目的探讨中华眼镜蛇毒活性组分(CCVAF)抗血管生成的作用。方法采用原代培养牛肺主动脉内皮细胞克隆形成实验、Transwell小室趋化实验及大鼠胸主动脉环体外无血清培养微血管样结构形成实验,分别观察CCVAF对内皮细胞克隆形成、细胞迁移及大鼠动脉环微血管生成的影响。结果 CCVAF浓度为1.25,2.5,5.0μg/mL时,其对内皮细胞克隆形成抑制率分别为17.7%,40.3%,62.9%,呈浓度依赖性(r=0.982,P<0.05),而对内皮细胞迁移抑制率分别为20.5%,59.0%,73.5%,呈浓度依赖性(r=0.902,P<0.05);大鼠动脉环培养至第13天,CCVAF组较溶剂对照组微血管生成率下降了86.5%,CCVAF+VEGF组较VEGF对照组微血管生成率下降了88.1%。结论 CCVAF能够抑制内皮细胞克隆的形成、Hela细胞诱导的内皮细胞迁移和大鼠动脉环微血管的生成。     

紫苏醇亚微乳剂对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用研究

目的:研究紫苏醇亚微乳剂对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用。方法:以紫苏醇溶液为对照,采用MTT比色法检测不同浓度(0、50、100、200、400、800μmol·L-1)紫苏醇亚微乳剂处理不同时间(24、48、72h)后对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率及半数抑制量(IC50)值,并设立空白组进行比较。结果:与空白组比较,试验组与对照组在作用24h、浓度高于400μmol·L-1,48h、浓度高于100μmol·L-1,72h、浓度高于50μmol·L-1时均表现出明显抑制作用(P<0.05);后2组抑制作用比较无显著性差异;试验组与对照组对MCF-7细胞株的IC50值分别为353.9、377.9μmol·L-1。结论:紫苏醇制成亚微乳剂后与其溶液比较,对人乳腺癌细胞MCF-7具有相同的抑制作用。     

广西眼镜蛇毒蛋白Natrin在体外诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用的研究

目的观察广西眼镜蛇毒蛋白Natrin在体外对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用及凋亡诱导作用。方法以不同浓度的Natrin作用于SMMC-7721细胞24 h后,用MTT法检测细胞的生长抑制率;AO/EB双染色法、透射电子显微镜法观察细胞凋亡、流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。结果 Natrin对人肝癌SMMC-7721细胞有体外抑制作用,随着药物浓度的增大抑制率也随之增大,24 h半数抑制浓度IC50为138.69 mg·L-1;给药后,荧光显微镜下与透射电子显微镜下细胞呈现典型的凋亡形态改变;流式细胞仪检测到随着药物浓度的增大凋亡百分数也随之增大;Natrin能诱导SMMC-7721细胞发生S期和G2/M期阻滞。结论Natrin在体外能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡。     

王不留行提取物对内皮细胞增殖、迁移及其黏附的作用评价

目的体外分析王不留行抑制人微血管内皮细胞(HMEC)增殖、迁移和黏附的有效部位。方法SRB法测定药物干预细胞增殖的IC50和药物作用时间与药效学的关系;划线灼伤法研究细胞迁移;体外基质胶分析药物对细胞黏附能力的影响;HE染色观察药物对细胞染色体的影响。结果王不留行有效部位对HMEC增殖抑制的IC50为3.60mg.L-1,加药4h后起作用。加药48h后HMEC迁移受到明显抑制(迁移率为40.33%,对照组迁移率为77.68%)。加药组细胞黏附受到明显抑制,且呈浓度依赖关系。结论王不留行提取物能明显抑制内皮细胞增殖、迁移及黏附,因此具有潜在的价值用于抑制血管生成。     

野木瓜果实总皂苷体外抗肿瘤作用研究

目的 研究野木瓜果实总皂苷对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL-7402和人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响.方法 将生长状态良好的A549细胞、BEL-7402细胞和SGC-7901细胞分为7组:阴性对照组,野木瓜果实总皂苷组(40、80、160、320、640 mg·L-1)组和丝裂霉素组(10 mg·L-1),药物作用12、24、48 h后,MTT法测定细胞增殖抑制率.结果 野木瓜果实总皂苷能显著抑制A549细胞、BEL-7402细胞和SGC-7901细胞的增殖,呈一定剂量和时间依赖关系,作用A549细胞12、24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为492.38、293.43、141.84 mg·L-1;作用BEL-7402细胞12、24、48 h的IC50分别为427.74、243.91、101.79 mg·L-1;作用SGC-7901细胞12、24、48 h的IC50分别为463.35、256.77、113.22 mg·L-1.结论 野木瓜果实总皂苷有明显抑制A549细胞、BEL-7402细胞和SGC-7901细胞体外增殖的作用,其中BEL-7402细胞对野木瓜果实总皂苷最为敏感.     

十二元环红霉素衍生物对T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨十二元环红霉素衍生物(LY267108)对T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响。方法用MTT法观察LY267108和红霉素对T淋巴细胞增殖的影响;用流式细胞仪经PI染色观察LY267108和红霉素对T淋巴细胞周期的影响。结果LY267108和红霉素抑制T淋巴细胞的增殖IC50值分别为(176.38±10.42)×10-6mol.L-1和(606.28±35.43)×10-6mol.L-1;在3.0~30.0 mg.L-1之间LY267108引起T淋巴细胞G2/M期周期阻滞;红霉素在30.0 mg.L-1和100.0 mg.L-1时出现凋亡峰。结论红霉素衍生物的抗炎活性可能与该类化合物对炎症细胞的影响有关。     

盐酸拓扑替康脂质体的体外细胞毒及体内抗肿瘤作用

目的对抗癌药物盐酸拓扑替康普通脂质体(Plain L)及PEG修饰脂质体(PEG L)的体外细胞毒及体内抗肿瘤作用进行研究。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定Plain L与PEG L对人卵巢癌细胞A2780和人结肠直肠癌细胞HCT 8的抑制作用;对荷肝癌H22小鼠尾静脉注射给药进行Plain L、PEG L的体内抑瘤试验。结果与游离药物相比,Plain L、PEG L的细胞毒作用增强,对体外培养的人卵巢癌A2780细胞的IC50分别为(9.26±2.14)mg.L-1和(2.36±1.08)mg.L-1,相比于游离药物[IC50=(25.45±1.69)mg.L-1]分别降低了63.6%(P<0.005)和90.7%(P<0.001);对HCT 8细胞,Plain L[IC50=(10.66±1.25)mg.L-1]与PEG L[IC50=(4.50±0.31)mg.L-1]的细胞毒作用也强于游离药物[IC50=(16.72±2.45)mg.L-1],分别是游离药物的1.5倍(P<0.001)和3.6倍(P<0.005)。体内抑瘤实验结果表明,游离药物、Plain L与PEG L体积抑瘤率分别为58.2%、67.6%、83.5%,质量抑瘤率分别为56.3%、69.6%、85.7%;与游离药物相比,Plain L与PEG L的体内抗肿瘤作用明显提高。结论与游离药物相比,脂质体包封提高了盐酸拓扑替康的体外细胞毒作用及体内抗肿瘤效果,而经PEG修饰的脂质体相比于普通脂质体体内、外抗肿瘤效果更强。     

三磷酸腺苷对国人食管癌Eca-109和肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

目的研究三磷酸腺苷(ATP)对人食管癌细胞株Eca-109和人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖的影响。方法采用MTT法测定ATP、腺苷(ADO)和三磷酸尿苷(UTP)抑制肿瘤细胞增殖的作用,W rights-G iem sa染色观察细胞形态学的改变。结果ATP(0.03~0.3 mmol.L-1)和ADO(0.1~0.3 mmol.L-1)可不同程度地抑制Eca-109和SMMC-7721的增殖,ATP对两株肿瘤细胞增殖的抑制作用均强于ADO。ATP和ADO对Eca-109细胞的最大抑制率分别为86.36%和29.88%,IC50分别为0.056和0.823 mmol.L-1;对SMMC-7721细胞的最大抑制率分别为82.06%和52.84%,IC50分别为0.218和0.517 mmol.L-1。UTP对Eca-109细胞有很弱的抑制增殖作用,最大抑制率仅为18.27%;对SMMC-7721无抗增殖作用。两株细胞经高浓度(0.3 mmol.L-1)ATP处理后,部分SMMC-7721细胞形态出现了明显的凋亡特征,而Eca-109细胞凋亡特征不明显。结论ATP具有较强的抗Eca-109细胞增殖作用,其抗增殖作用主要由ATP自身所致,代谢产物ADO也具有一定的作用;而对于SMMC-7721细胞,ATP可能较大程度地通过降解为ADO而发挥抗增殖作用。     

金荞麦Fr4诱导HL-60细胞凋亡及对端粒酶活性的影响

目的研究金荞麦有效部位Fr4能否诱导HL-60细胞凋亡及对端粒酶活性的影响。方法用MTT法检测Fr4对细胞增殖的影响;光学显微镜和透射电镜观察细胞形态改变;Annexin-V/PI双染法检测细胞膜介导的凋亡;琼脂糖凝胶电泳观察DNA碎片;TRAP-PCR-ELISA检测端粒酶活性。结果金荞麦Fr4 60~240 mg.L-1能诱导HL-60细胞凋亡,电镜观察到典型的凋亡细胞,电泳呈现出阶梯状条带,流式细胞仪检测到早期凋亡细胞数随剂量的增加而升高。MTT法示金荞麦Fr4抑制HL-60细胞增殖,并且呈剂量依赖性趋势,药物作用24 h的IC50为115 mg.L-1,Fr4诱导HL-60细胞凋亡过程中,端粒酶活性下降。结论金荞麦Fr4可诱导HL-60细胞凋亡,其机制可能与端粒酶活力下降有关。     

蛇毒神经生长因子对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及肝纤维化相关蛋白质表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒神经生长因子(NGF)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖、凋亡以及蛋白质表达差异的影响,进一步为蛇毒NGF抗肝纤维化提供依据。方法实验分为对照组(单纯HSC-T6培养)和实验组(NGF进行干预)。应用MTT检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞凋亡的影响;双向电泳技术观察HSC-T6细胞蛋白质表达变化;质谱鉴定差异表达的蛋白。结果 MTT结果显示NGF对HSC-T6细胞增殖具有明显抑制作用(5 mg.L-1NGF时抑制率为48.2%±1.9%,P<0.01);流式细胞仪也有同样的发现,NGF(5 mg.L-1)干预组的凋亡率21.15%±3.31%明显高于对照组的2.7%±1.55%(P<0.05);比较分析空白对照组和NGF作用组的2-DE图谱,找到差异蛋白质点47个,其中与对照组相比在NGF作用组表达上调22个,下调25个;质谱鉴定出9个蛋白质,其中4个表达上调,5个表达下调。结论蛇毒NGF能抑制大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖,诱导其凋亡,并且影响HSC-T6细胞蛋白质的表达。     

广西眼镜蛇毒细胞毒素的分离及对人鼻咽癌等细胞抑制作用的研究

目的　探讨广西眼镜蛇毒细胞毒素对人鼻咽癌细胞(CNE)等多种癌细胞株的抑制作用。方法　经SephadexG 5 0 ,CM SepharoseCL 6B层析法从广西眼镜蛇毒中分离纯化获得细胞毒素 (CTX) ,采用MTT检测CTX对癌细胞株体外培养抑制作用 ,探索量效时效关系。结果　从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素单一组分 (CTXCM 5 )对体外培养的人鼻咽癌细胞株 (CNE)、淋巴瘤细胞株 (YAC)、人宫颈癌细胞株 (HELA)和卵巢癌细胞株 (Ho8990 )的抑制有明显的剂量依赖关系 ,作用 48h的IC50 分别为 1 84,0 75 ,1 84和 2 5 9mg·L-1;随作用时间的延长 ,CTXCM 5对CNE细胞株作用最为明显 ,作用 3h和 2 4h的IC50 分别为 4 78和1 0 4mg·L-1。结论　CTXCM 5对体外培养的癌细胞株有较强的抑制作用。