高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽对肝癌侵袭和转移的影响

目的 研究高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽(AWYPLPP肽)对肝癌侵袭和转移的影响.方法 采用Matrigel侵袭实验、迁移实验、二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)实验以及黏附实验,探讨AWYPLPP肽对高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3侵袭表型的影响.裸鼠皮下接种HCCLM3细胞,建立肿瘤肺转移模型,观察AWYPLPP肽对HCCLM3肺转移的影响.结果 侵袭实验结果显示,在AWYPLPP肽浓度为0.1～100 μmol/L时,能显著促进HCCLM3细胞的侵袭能力,呈剂量效应关系.迁移实验、MTT实验和黏附实验表明,AWYPLPP肽对HCCLM3细胞的迁移、增殖和黏附能力无影响.HCCLM3细胞皮下接种30 d后处死裸鼠,AWYPLPP肽组出现明显的肺转移,肺转移率为88.9%(8/9),与PBS组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但对皮下肿瘤的生长无明显影响.结论 AWYPLPP肽能促进高转移潜能人肝癌细胞体外侵袭能力以及肿瘤肺转移;进一步寻找肿瘤细胞表面与AWYPLPP肽结合的受体,可能为深入研究肝癌侵袭转移的机制和设计干预治疗的靶点提供新思路.     

肿瘤外周酸性微环境促进肝癌HCCLM3细胞的转移

目的:探讨肿瘤外周酸性微环境对肝癌HCCLM3细胞转移的影响.方法:将肝癌细胞HCCLM3分别培养在不同pH值(pH 7.4、pH 7.0和pH 6.6)的细胞培养液中,通过细胞体外迁移实验和体外侵袭实验分析HCCLM3细胞在迁移和侵袭能力方面的改变,通过Western印迹、明胶酶谱及原位酶谱法分析HCCLM3细胞在基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase-2,MMP-2)合成、分泌和激活方面的变化.结果:当细胞外周微环境向酸性变化时,HCCLM3细胞的迁移及侵袭能力均明显增强(P<0.01),虽然细胞内MMP-2的合成未发生明显改变,但细胞分泌的MMP-2及MMP-2的激活均明显增强(P<0.01).结论:细胞外周酸性微环境可以上调细胞MMP-2的分泌及激活,并促进肝癌细胞HCCLM3的体外侵袭和迁移能力,提示肿瘤外周酸性微环境对肝癌细胞HCCLM3的转移具有促进作用.     

鼻咽癌变不同时期的体外三维培养模型建立的实验研究

背景与目的:三维培养更能模拟体内细胞的微环境,细胞的生物学特性比二维培养更接近于活体组织。本研究建立能反映鼻咽癌变过程中不同时期的鼻咽上皮细胞三维培养模型,为进一步研究鼻咽癌的发病机制提供模型。方法:非癌鼻咽活检标本体外培养用于建立鼻咽正常细胞;早期和晚期传代的正常细胞NPNE2、永生化的鼻咽上皮细胞NP69SV40T、鼻咽癌细胞SUNE-1及其高转移潜能亚株5-8F在Matrigel中培养,建立三维培养模型。结果:从非癌鼻咽活检标本长出具有上皮细胞形态特征的细胞,细胞出现衰老前,在体外能够增殖8～10代,角蛋白免疫组化证实其为上皮起源。除晚期传代的NPNE2外,所有细胞均能在三维体系中增殖,NPNE2及NP69SV40细胞主要形成网状结构,克隆形成数少,边沿清楚而光滑,并且细胞间连接紧密;SUNE-1和5-8F形成大而形态不规则的克隆,细胞间连接松散并且克隆边沿不规则,此外,5-8F尚形成大量的伪足,但不形成网状结构;而晚期传代的NPNE2增殖能力低,无法形成细胞网状结构,也不形成细胞克隆。结论:从非癌鼻咽活检标本成功培养出正常鼻咽上皮细胞,采用正常细胞、永生化鼻咽上皮细胞及肿瘤细胞建立了可能反映体内鼻咽癌发生、发展不同时期的三维培养模型。     

精氨酸对皮下移植性肝癌生长的影响

精氨酸对皮下移植性肝癌生长的影响黄从云，陈君显，罗伯诚，杨冠群精氨酸是一种半必需氨基酸，对机体免疫有促进作用［１］。动物实验表明大剂量精氨酸可抑制许多实验性肿瘤的形成、生长和转移［２］。郭长江等在体外培养中证实高浓度精氨酸可抑制肝癌细胞繁殖［３］。最...     

miR-421通过抑制PDCD4发挥促进肝癌的作用

摘 要：［目的］ 分析miR-421通过靶向调控PDCD4的表达水平在肝癌的发生及发展中的作用。［方法］ 通过构建肝癌裸鼠移植瘤模型检测miR-421对移植瘤生长的影响;检测miR-421在肝癌细胞株及肿瘤组织中的表达量及其过表达在高/低侵袭转移能力肝癌细胞模型中对侵袭能力的影响;TargetScan预测miR-421的潜在靶基因,并采用双荧光素酶报告基因法验证,qRT-PCR和Western blot检测miR-421对靶基因的调控作用;检测PDCD4在肝癌细胞株肿和肿瘤组织中的表达;CCK8、流式细胞法、Tranwell和细胞划痕检测miR-421与靶基因对肝癌细胞增殖、周期、侵袭和迁移的调控。［结果］ 肝癌裸鼠移植瘤模型中过表达miR-421可促进肝癌细胞的增殖及肿瘤的生长。miR-421在肝癌细胞及肿瘤组织中均呈高表达并且上调其表达可提高肝癌细胞的侵袭能力。PDCD4受miR-421的靶向调控,并在肝癌细胞及肝癌肿瘤组织中呈低表达。miR-421过表达可促进肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移及S期阻滞,但PDCD4可逆转这种促进效果。［结论］ miR-421通过负性调控靶基因PDCD4在肝癌中扮演促癌基因的角色。     

人肺癌不同转移潜能细胞株的建立及其特性分析

目的:建立人肺癌不同转移潜能细胞株,并对其转移特性进行初步研究,为肺癌转移机制的研究提供模型. 方法:采用有限稀释单细胞克隆培养的方法,从已建立的人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci中分离出的不同单克隆细胞,通过体外损伤愈合、迁移与侵袭实验,体内皮下移植瘤自发性转移实验,比较分离出的不同细胞株之间以及与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci之间运动、迁移、侵袭及转移能力的差异. 结果:从SPC-A-1sci细胞株中成功分离出3株单克隆细胞(命名为SPC-A-1sci-C5、SPC-A-1sci-F3、SPC-A-1sci-C2),均具有特异性形态学特征;与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci相比,SPC-A-1sci-C5细胞株的体外侵袭能力明显增强,其他2株细胞的体外侵袭能力则明显降低;3株单克隆细胞在细胞形态和体外侵袭能力方面存在明显差异,SPC-A-1sci-C5的体外侵袭能力明显高于其他2株细胞.体内皮下移植瘤自发性转移试验显示,SPC-A-1sci-C5细胞不仅转移发生时间较早,而且肺转移程度(包括转移灶数量及大小)亦较其他2株细胞增多.结论:成功建立了具有相同遗传背景、不同转移潜能的3株人肺癌细胞,为肺癌转移的进一步研究提供了理想模型.     

高转移性人乳腺癌细胞亚克隆的筛选

目的筛选高转移潜能的人乳腺癌细胞亚克隆,为人类乳腺癌转移相关的体内外研究提供实验对象。方法通过有限稀释法分离和培养人乳腺癌细胞MDA-MB-435S的单克隆;采用细胞生物学方法体外评价亚克隆的克隆形成、增殖、运动和侵袭能力;将MDA-MB-435S亚克隆细胞通过乳腺脂肪垫接种于免疫双缺陷SCID鼠,验证体外筛选克隆的体内转移能力。定量资料采用独立样本t检验进行统计学分析。结果筛选得到MDA-MB-435S的高转移亚克隆14-E5;14-E5与亲代细胞呈梭形、伪足较长的细胞形态明显不同,体积比亲代细胞小,呈多边形,触角增多;细胞的体外克隆形成能力、运动能力、侵袭能力及体内自发转移能力均较亲代显著增强(P0.050);细胞周期S期和G2/M期比例比亲代减少,增殖能力较亲代降低(t=7.047,P=0.002);细胞异质黏附能力、体内成瘤率与亲代之间的差异无统计学意义(P0.050)。结论筛选并建立了高转移潜能人乳腺癌细胞亚克隆细胞株14-E5,可以用于乳腺癌转移基因筛选、转移机制研究、抗转移药物的研发和评价抗转移实验性治疗疗效。     

高表达ANXA2肝癌干细胞外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性的调控作用

摘 要：［目的］ 探讨肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的蛋白质,重点分析外泌体ANXA2分子对肝癌恶性生物学特性（自我更新、侵袭和转移能力）的影响。［方法］ 采用无血清悬浮培养法和干细胞标志物流式分选术分离人肝癌干细胞;分别采用干细胞球形成实验、体外侵袭转移能力鉴定分离所得肝癌干细胞;采用蛋白质谱分析肝癌干细胞来源外泌体中的差异表达蛋白质;siRNA靶向抑制ANXA2表达后,分别进行肝癌细胞球形成实验、体外侵袭与迁移实验检测外泌体ANXA2对人肝癌细胞自我更新、侵袭、转移能力的影响;收集肝癌患者和正常人血浆,通过凝胶排阻层析联合CD63免疫磁珠分离纯化外泌体,Western blot检测外泌体中ANXA2表达情况,结合临床病理资料,综合分析外泌体ANXA2的临床相关性。［结果］ 成功分离得到肝癌干细胞CD133+ SK-Hep-1,其具有典型的肿瘤干细胞生物学特性。与CD133- SK-Hep-1细胞外泌体相比,CD133+ SK-Hep-1肝癌干细胞来源外泌体中具有多种差异表达蛋白,其中外泌体ANXA2表达明显上调。siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2表达后,其外泌体中ANXA2表达也下降。分别采用PBS、siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2后外泌体（Exo-LCSCs-siANXA2）、肿瘤干细胞来源外泌体（Exo-LCSCs）刺激肝癌细胞系HepG2、SNU398,其自我更新、侵袭和转移能力依次增强。Western blot结果显示,肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达明显高于健康人血浆;肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达与患者年龄、性别无明显相关性,而与肿瘤TNM分期和转移显著相关。［结论］ 高表达ANXA2的肝癌干细胞的外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性具有调控作用。     

人肝细胞癌组织肿瘤相关巨噬细胞的浸润水平及其临床意义

摘 要：［目的］ 通过检测人肝细胞癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的浸润水平和特点,探讨肿瘤相关巨噬细胞在肝癌发生、进展中的作用。［方法］ 以CD68分子为巨噬细胞标志,采用免疫组织化学法检测116例肝细胞癌肿瘤组织巨噬细胞的浸润水平和特点。［结果］ 肝细胞癌组织中CD68阳性表达率为94.8%(110/116),而癌旁组织为17.2%(20/116)。巨噬细胞的浸润水平在不同TNM分期、是否存在血管侵袭、淋巴结转移及微卫星病灶分组间均有统计学差异(P<0.05),与患者预后呈负相关(P=0.001)。［结论］人肝细胞癌组织肿瘤相关巨噬细胞呈高浸润状态,且浸润水平与多项临床病理特征和预后密切相关,提示其可能参与了肝癌的发生、进展。     

肝癌高转移细胞株的肿瘤干细胞生物学特性研究

目的:建立高转移肝癌细胞株,研究其肿瘤干细胞生物学特征,为靶向人肝癌干细胞治疗提供有价值的细胞模型。方法:肝癌细胞系Bel7402接种裸鼠皮下,成瘤后,取小鼠肺部转移灶,通过机械分离法,获取肺部肝转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移肝癌细胞株Bel7402-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定Bel7402-V13中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术分析亲本Bel7402和Bel7402-V13中肿瘤干细胞标志物ESA的表达情况,分选Bel7402和Bel7402-V13中ESA+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验。结果:建立高转移Bel7402-V13细胞株,Bel7402-V13细胞无血清悬浮培养7d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。与Bel7402中ESA+细胞相比,流式分析显示干细胞标志物ESA比例高转移Bel7402-V13显著提高5.67倍（17.6±0.4 vs 3.1±1.5）。Bel7402-V13中ESA+细胞具有更强的自我更新能力［成球率:（94.8±7.5）% vs （52.3±6.9）%,P<0.01］,侵袭能力提高1.51倍（397.7±79.4 vs 262.0±40.1,P<0.01）,耐药能力也显著增强（IC50:0.286 vs 0.196,P<0.01）,ESA+细胞Bel7402-V13在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月即可致瘤（3/6）,而接种2×102个ESA+细胞Bel7402细胞3月才能致瘤（1/6）。结论:获得高转移肝癌细胞株Bel7402-V13,伴随ESA+细胞增加,其体内外功能显著增强,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型。     

褪黑素对肺癌A549细胞诱导的血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨褪黑素在体外共培养条件下对肺腺癌A549细胞诱导血管内皮细胞增殖的影响及相关机制。方法建立肺腺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECS）ECV-304共培养模型,实验共分成四组：Con组(对照组),nM组(褪黑素终浓度1 nM/L),μM组(褪黑素终浓度1 μM/L),mM组(褪黑素终浓度1 mM/L)。采用BrdU法观察不同浓度褪黑素对血管内皮细胞（ECV-304）增殖的影响,细胞迁移实验观察褪黑素对血管内皮细胞活力的抑制作用,ELISA法检测褪黑素对肺腺癌细胞VEGF蛋白表达的影响。结果低浓度的MLT(1 nM/L)对HUVECs增殖无明显影响,但高浓度 MLT(1 mM/L)明显抑制HUVECs增殖,并有浓度依赖倾向; 高浓度的褪黑素明显降低肺腺癌A549细胞培养液中VEGF的表达。 结论高浓度的褪黑素可以抑制肺腺癌细胞诱导的血管内皮细胞的增殖及迁移,其作用机制可能与褪黑素抑制肺腺癌细胞VEGF的表达有关。     

Cell Cycle Perturbations of Platinum Derivatives on Two Ovarian Cancer Cell Lines

Cisplatin continues to be one of the most commonly used cytotoxic agent. Problems of drug resistance and nephrotoxicity have generated interest in new platinum derivatives. In this study, we used flow cytometry to study their effects on cell kinetics and to see if the extent of cell cycle perturbations can be used to determine relative potency. The following four platinum derivatives were tested: cisplatin, carboplatin, 2543, and NK121 on two human ovarian cancer cell lines: BG1 and CAOV3. Flow cytometric analysis revealed a dynamic spectrum of cell kinetic perturbations, which included sequential S-G2 block, concomitant S-G2 block, and a dominant S block with abolition of G2 block. Platinum derivatives NK121, 254S, and CARBO induced an average of 54.5 ±5.6, 21.2 ± 5.5, and 2.5 ± 2.8% more S-G2 blocks than cisplatin, respectively. When comparing the severity of S-G2 blocks and requiring a p-value of 0.05, the order of increasing potency was: cisplatin, carboplatin, 2543, and NK121.     

人干扰素对HL60,K562细胞生长及细胞周期的影响

用人干扰素(α和γ)与HL60、K562细胞共同培养后,对细胞生长有不同程度抑制作用。IFN_r对细胞生长抑制作用强于IFN_r,IFN_r和IFN_r联合应用有协同作用,在K562细胞,细胞在细胞周期中的分布也发生改变,G_0/G_1期细胞比例减少,S期细胞比例增高,在HL60细胞则无明显的细胞周期再分布情况。提示细胞在S期的堆积是细胞生长受抑的原因之一。     

Anticancer Activity of Fucoidan via Apoptosis and Cell Cycle Arrest on Cholangiocarcinoma Cell

Objective: Many previous studies reported that fucoidan has antitumor activities. The objective of the present study was to determine the cytotoxic effects and related mechanisms of cell death induced by fucoidan extracted from Fucus vesiculosus on CL-6 cholangiocarcinoma cell. Methods: CL-6 and OUMS cells were treated with 0, 100, 200, and 300 μg/mL of fucoidan. MTT assay was used to determine cytotoxicity. Flow cytometry-based assay was used to examine the distribution of apoptosis and cell cycle. The changes in nuclear morphology were determined using Hoechst 33,342 staining. Mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was evaluated using the JC-1 kit. The apoptotic, anti-apoptotic, and cell cycle-related proteins study were examined by Western blot analysis. Results: The relative viable cell number of treated CL-6 cells was decreased but no effect was observed in OUMS normal cells. Furthermore, treated cells were arrested in the G0/G1 phase with down-regulation of cyclin D1 and CDK4. Annexin V/PI staining with flow cytometry analysis suggested that fucoidan could induce apoptosis in CL-6 cells. Western blot study revealed the up-regulation of apoptotic markers including Bax, cleaved PARP, cleaved caspase-3, but down-regulation of anti-apoptotic markers,  cl-2. Moreover, fucoidan could induce nuclear fragmentation and chromatin condensation with alteration of ΔΨm.  Conclusion: Fucoidan exerts antitumor properties against CL-6 cholangiocarcinoma cells illustrated by the induction of apoptosis and cell cycle arrest.     

二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞周期的阻滞作用

[目的]探讨二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌HT-29细胞周期的阻滞作用及其分子机制.[方法]应用MTF法及细胞计数法测量HT-29细胞生长抑制,流式细胞术检测细胞时相分布,免疫细胞法测定p21、C-myc、Cyclin E表达.[结果]MTT法显示,不同浓度DADS作用HT-29细胞12、24、48h后,细胞生长抑制率及细胞群体倍增时间呈浓度、时间依赖性增加.流式细胞仪分析,30、60pmol/LL DADS阻滞HT29细胞在G1期,与对照组相比,可使G1期细胞增加约2倍,而90、120μmol/L DADS显著地将细胞阻滞在G2/M期.免疫细胞化学分析表明在细胞周期阻滞的同时有p21wafl蛋白表达上调,Cyclin E、C-myc蛋白表达下降.[结论]DADS对HT-29细胞的抑制增殖作用可能与细胞周期阻滞有关,DADS对HT-29细胞周期阻滞的分子机制可能与调节p21wafl、Cyclin E、C-myc表达相关.     

呋喃唑酮对Hep G2肝癌细胞增殖和细胞周期的影响

背景与目的:探讨呋喃唑酮(furazolidoze,YZD)对体外培养的人肝癌细胞(Hep G2)的毒性机制.材料与方法:分别以不同浓度FZD(0.00、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00μg/ml)作用Hep G2细胞24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定FZD对细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期的分布;RT-PCR半定量检测S期关卡相关基因的变化. 结果:随着FZD浓度的增加,Hep G2细胞的存活率逐渐降低,当浓度超过6.25 μg/ml时,细胞存活率下降显著(P＜0.05);细胞生长曲线显示各染毒浓度组细胞生长速度明显减慢;细胞周期动力学显示FZD在0～3.12μg/ml范围内S期细胞比例明显增加,G1期细胞比例下降;RT-PCR结果显示FZD作用后p21呈高表达,cyclinE、cyclinA和Cdk2表达量则不同程度下调.结论:FED对体外培养的Hep G2细胞有一定的细胞毒性且诱导S期阻滞,其增殖抑制作用可能是通过激活S期损伤关卡实现的.     

长春新碱对鼻咽癌细胞增殖和周期的影响

[目的]探讨长春新碱(VCR)对鼻咽癌CNE鄄2Z细胞增殖和周期的影响。[方法]MTT法检测增殖抑制率和IC50,流式细胞术分析细胞周期。[结果]不同浓度的VCR分别处理细胞24h、48h、72h时,抑制率随浓度的增加和时间的延长而增加,其IC50分别为(2.01±0.26)、(1.59±0.23)、(0.92±0.11)μg/ml,各IC50间的差异有非常显著性意义(P<0.01)。0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/mlVCR分别处理细胞6h、12h、24h时,G0/G1期细胞明显下降,G2/M期细胞明显升高,随时间的延长变化更明显(P<0.01)。[结论]VCR对CNE鄄2Z细胞具有增殖抑制作用,该抑制作用具有剂量和时间依赖性;阻滞细胞于G2/M期,此阻滞作用具有时间依赖性;一定剂量的VCR可能通过阻滞CNE鄄2Z于G2/M期而抑制其增殖。     

氧化苦参碱抑制肝癌细胞诱导血管内皮细胞增殖作用的研究

目的探讨氧化苦参碱(OM)对肝癌细胞诱导血管内皮细胞(VEC)增殖的抑制作用.方法用 MTT 法检测不同浓度 OM 对 VEC、人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖及 SMMC-7721 细胞诱导 VEC 增殖的影响.结果 OM 浓度为 2.5～10 mg/mL 时,对 VEC 增殖的抑制率为 4.6%～36.4%;OM 浓度为 0.313～10 mg/mL 时,对肝癌细胞增殖的抑制率为 2.53%～88.61% ;经浓度为 1.25～10 mg/mL OM 作用后的肝癌细胞培养液对 VEC 增殖的抑制率为 7.69%～38.46% ;OM 浓度为 0.625～10 mg/mL 时,对肝癌细胞培养液诱导的 VEC 增殖的抑制率为 3.57%～57.54%.结论 OM 对肝癌细胞诱导的 VEC 增殖具有抑制作用.     

热化疗联合作用抑制人小细胞肺癌细胞增殖的机制

目的 研究热化疗联合作用对肺部肿瘤细胞生长的抑制及其可能的机制。方法 参考临床常用剂量,采用43 ℃加热联合120 μg/L紫杉醇、43 ℃加热联合120 μg/L紫杉醇及20 μmol/L JNK特异抑制剂SP600125以及单纯使用120 μg/L紫杉醇处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照。应用噻唑蓝比色法检测各处理方式下细胞增殖率的变化,通过蛋白免疫印迹法检测JNK磷酸化水平和Caspase 3表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,运用SPSS 13.0对数据进行统计分析。结果 热化联合组细胞增殖率最低(P<0.05);JNK磷酸化水平在热化联合组中表达明显增高(P<0.05),SP600125可抑制其磷酸化(P<0.05);热化联合组的Caspase 3增高(P<0.05),SP600125使其表达减少(P<0.05);热化联合组细胞凋亡率增加(P<0.05),SP600125组细胞凋亡率减少(P<0.05)。结论 热化疗联合应用可以明显增加紫杉醇对H446细胞生长的抑制作用,且这种抑制作用可能是通过激活JNK信号转导通路,继而通过Caspase 3途径激活细胞凋亡来实现的。