HBV DNA及HBxDNA亚片段在肝癌细胞内的整合及作用

为探讨ＨＢＶＤＮＡ及其亚基因片段ＨＢｘＤＮ在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）中整合特点用机制，制备了地高辛标记的３．２ｋｂＨＢＶＤＮＡ全基因及０．５９ｋｂＨＢＶＤＮＡ／ＢａｍＨＩ，ＢｇｌⅡＢＨｘＤＮＡ亚基因探针。点杂交、原位杂交及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测ＨＢＶＤＮＡ的存在情况，筛选ＨＢＶＤＮＡ纯整合标本，以ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢｘＤＮＡ在ＨＣＣ染色体的整合。结果显示ＨＢＶＤＮＡ在肝细胞内以核型为主（７０％）     

应用原位杂交法探讨肠道病毒感染与扩张型心肌病的关系

作者从含柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）ｃＤＮＡ重组质粒（ｐＧＰ５１Ｂ）的大肠菌中提取、纯化ＣＶＢ３ｃＤＮＡ片段，用缺口平移法将Ｂｉｏ１１－ｄＵＴＰ掺入目的基因，制备ＣＶＢ３ｃＤＮＡ探针。通过原位杂交技术检测了４０例组织学诊断为扩张型心肌病的心肌活检标本，并以５例正常心肌标本作阴性对照。结果４０例心肌活检标本中有１８例与该探针杂交出现阳性结果，５例正常对照心肌标本杂交均为阴性，从而确定扩张型心肌病的心肌     

地高辛素标记弓形虫DNA探针的制备及在产前诊断的应用

本文建立了地高辛素标记的弓形虫ＤＮＡ探针并在２３例产前咨询孕妇中作产前诊断。通过聚合酶链反应扩增弓形虫ＲＨ株ＴＧＲ４核酸片段，扩增产物７７８ｂｐ片段经寡核苷酸层析柱纯化后，用地高辛素标记作为探针，与待检材料斑点杂交。结果显示该探针与待杂交的弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ１株ＤＮＡ杂交；而与恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、杜氏利什曼原虫、大肠杆菌、巨细胞病毒ＤＮＡ无杂交。并能在待杂交液中检测出相当于１ｐｇ水平ＤＮＡ，表明该探针具有高度的特异性及敏感性。检测２３例孕期１０—１４周孕妇中，阳性３例，其中一孕妇外周血、绒毛组织及羊水均呈阳性。另一例的外周血及绒毛组织呈阳性。该探针稳定、敏感、操作简单，具有推广意义。     

HBV DNA在血清HBV标志物阴性肝炎肝组织中的表达

１．资料与方法：肝穿刺活检组织４５例均取自１９９５～１９９７年传染科住院患者，用ＥＬＩＳＡ 法检测血清ＨＢＶ标志物及常规ＰＣＲ 检测血清 ＨＢＶ ＤＮＡ均为阴性。男３９例，女６例，年龄１２～５６岁。临床诊断：急性黄疸性肝炎２４例；慢性肝炎：轻度１３例，中度３例，重度１例；肝硬化４例。肝组织原位杂交：带有ＨＢＶ全基因组的重组ＰＣＲ１０质粒，经ＰＣＲ扩增，获Ｓ基因 ５００ ｂｐ片段，经 ＤＮＡ回收试剂盒回收，以其作为裸探针，采用地高辛标记试剂盒制备探针。常规脱蜡入水，０．２盐酸室温消化 ２０ ｍｉｎ，蛋白酶 …     

γ-干扰素对肝星状细胞表达α1(I)mRNA信号传递途径的影响

探讨ＩＦＮ－ｒ对ＨＳＣ前胶原基因表达的信号传递途径影响。 一、材料与方法 １．鼠ａ１（Ｉ）ＣＤＮＡ、ａ１（ＩＩＩ）ｃＤＮＡ及磷酸一３一甘油醛脱氢酶（ＧＡＰ）ｃＤＮＡ探针制备及标记：小鼠ａ１（Ｉ）及ａ１（ＩＩＩ）胶原ｃＤＮＡ重组质粒和用做内标准的ＧＡＰｃＤＮＡ克隆由ＤｅＣｒｕｍｂｒｕｇｇｈｅ提供,插入片断 ａ１（ Ｉ）为 ３２１ｂｐ． ａ１（ＩＩＩ）为 １ｋｂ,ＧＰＡ为 １．２ ｋｂ。按地高辛标记的 ＤＮＡ检测试剂盒（德国宝林曼）说明操作,标记探针浓度分别为 ５２ｎｇ／ｍｌ、 ４８ｎｇ／ｍｌ和５４ ｎｇ／ｍｌ…     

乙型肝炎病毒感染经精子传播的可能性研究

目的研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染经精子传播的可能性。方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）患者精子中的ＨＢＶＤＮＡ（地高辛配基标记探针原位杂交及３２Ｐ标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交法）；并用正常人精子进行ＨＢＶＤＮＡ俘获试验；对引产胎儿标本进行ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ（ＡＢＣ免疫组化法）及ＨＢＶＤＮＡ的检测。结果在２２例慢性乙肝患者精子标本中，３例检出ＨＢＶＤＮＡ，分布于精子的膜部和核心部。对母亲无ＨＢＶ感染、父亲为慢性ＨＢＶ感染者的４例胎儿的检测表明，在１例胎儿的肝、小肠、肾、肺、骨骼肌中检出了３．２ｋｂ的游离型ＨＢＶＤＮＡ及ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ的表达；该胎儿的父亲精子亦检出ＨＢＶＤＮＡ。体外试验表明正常人活精子能俘获ＨＢＶＤＮＡ，被俘获的ＨＢＶＤＮＡ在精子内的分布位置与乙肝患者精子相同。结论乙肝病毒可能通过感染精子垂直传播，精子被感染的机制涉及对ＨＢＶＤＮＡ的主动性捕获     

聚合酶链反应掺入法制备标记探针检测弓形虫感染的研究

本文采用聚合酶链反应（PCR）技术，以Dig一i1—dUTP代替部分dTTP直接制备标记弓形虫特异性rDNA基因片段作为探针，用于检测弓形虫感染。该探针和弓形虫核酸抽提物杂交阳性，而与恶性疟原虫、间日疟原虫、杜氏利什曼原虫以及正常人血样核酸抽提物杂交阴性，该探针至少可检测出相当于156虫数的水平，结果表明：PCR掺入法是一种简便、有效的制备标记探针的方法，以该法制备的弓形虫rDNA基因探针适用于弓形虫感染的诊断及流行病学调查研究。     

原位杂交检测子宫内膜癌中金黄色葡萄球菌L型DNA

目的 研究细菌Ｌ型感染与子宫内膜腺癌的相关性。方法 用革兰染色、免疫组化和ＤＮＡ核酸探针原位杂交等方法，以６６例子宫内膜腺癌，３０例子内膜增生症进行检测。结果 子宫内膜腺癌和内膜增生症中革兰氏染色细菌Ｌ型阳性率分别为５４．５％，５６．７％；免疫组化染色（Ｓ－Ｐ法）检测阳性率分别为５６．１％和６０．６％；２０例子宫内膜腺癌标本，用金黄色葡萄球菌（金葡菌）Ｌ型地高辛标记的核酸探针作原位杂交，结果发现４     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶基因真核表达载体的构建及序列测定

目的 扩增日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段，构建其重组真核表达载体，以研制ＳｊＧＳＴ核酸疫苗。方法 根据已知基因序列设计一对引物，运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因片段，将其克隆到ｐｃＤＮＡ３质粒中，并经酶切、ＰＣＲ鉴定，测序证实。结果 获得ＧＳＴ－ｐｃＤＮＡ３重组克隆。结论：本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆，为进一步研制核酸疫苗创造了条件。     

基因组、克隆重组DNA探针平行检测恶性疟原虫的初步研究

本文报告实验室制备恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ分离株）基因组ＤＮＡ．酶切冻融回收克隆重组ｐＰＦ１４ＤＮＡ，经３２Ｐ缺口移位法标记作为探针，按ＤＮＡ—ＤＮＡ斑点杂交试验平行检测Ｐ．ｆ．ＤＮＡ及血样中恶性疟原虫的初步结果．两探针检测人工培养的恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ）敏感度，基因组探针为０．０００７８％原虫血症和７．８３ｐｇ原虫ＤＮＡ，ｐＰＦ１４探针为０．００７８％和１５．６３ｐｇ。镜检确诊并复核后的５６例云南恶性疟病人血样，基因组探针检出５３例（９４．６４％），ｐＰＦ１４探针检出５１例（９１．０７％）．９例间日疟病人血样，基因组探针阳性７例，ｐＰＦ１４探针均未显示杂交．２例伯氏鼠疟、１例刚地弓形虫阳性鼠及１０例正常人血样皆为阴性．结果揭示：这两种探针似可用于我国疟疾主要流行区恶性疟原虫检测。与基因组探针相比，ｐＰＦ１４探针似是发展适合于我因恶性疟原虫大规模核酸诊断技术中，比较经济、方便的探针来源。     

原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察

观察原位PCR方法在弓形虫感染病原学检测中的效果。以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、 4、 6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以直接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA ,与免疫组化方法检测冷冻切片标本的结果相比较。 18例直接原位PCR法检测标本中均得到阳性信号 ,病原体检出率为 10 0 % ,优于免疫组化法 (11/18)。直接法原位PCR为检测病理标本中的弓形虫DNA提供了一种新的可行方法。     

Sensitive and specific detection of toxoplasma DNA in an experimental murine model: use of Toxoplasma gondii-specific cDNA and the polymerase chain reaction

Toxoplasma gondii, an apicomplexan parasite of mammals and birds, is well recognized as a cause of encephalitis in AIDS patients and as a cause of congenital infections. The polymerase chain reaction (PCR) and toxoplasma cDNA clones were used to diagnose T. gondii infection in an acute murine model of toxoplasmosis. Diagnosis of tissue infection by Southern blot hybridization with cDNA clones of T. gondii was possible within 5 days of infection. This technique could detect as few as 10,000 organisms. Specific T. gondii gene amplification by PCR using the primers 5'CACACGGTTGTATGTCGGTTTCGCT3' and 5'TCAAGGAGCTCAATGTTACAGCCT3' followed by oligonucleotide hybridization using 5'GCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCA3' allowed detection of T. gondii in the tissue of mice by day 2 after infection and in the blood of mice by day 5 after infection with RH strain T. gondii. This technique could detect as few as 10 organisms. Thus, these techniques may be useful in the diagnosis of toxoplasmosis.     

小鼠口服弓形虫DNA混合疫苗的免疫保护反应

目的 观察携带弓形虫表面抗原复合基因重组沙门氏菌经口免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫反应。 方法 构建弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2复合基因真核表达质粒，将其转入减毒鼠伤寒沙门氏菌BRD509 (BRD509/pSAG1/SAG2)，经口服免疫BALB/c小鼠，以携带空载体质粒的减毒沙门氏菌BRD509及生理盐水（NS）组为对照，分别于每次免疫前和免疫后断尾取血，并于末次免疫后第4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性、天然杀伤细胞（NK细胞）活性和T细胞亚群；ELISA法测定IgG抗体及血清中的细胞因子干扰素（IFN-γ），白介素-4（IL-4）。与末次免疫后4周，每只小鼠腹腔注射0.1 ml(10⁵)弓形虫RH株速殖子攻击，观察小鼠存活时间。 结果 免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高，滴度为1∶100；NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强，其中NK细胞杀伤活性为85%±7%，T细胞增殖指数为2.83，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。免疫鼠攻击感染后平均存活时间比对照组长5 d。 结论 弓形虫口服DNA混合疫苗可诱导小鼠产生保护性免疫。     

弓形虫感染家兔精液中虫体DNA检测初报

目的了解弓形虫感染家兔精液中是否有虫体存在，探明虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子不同剂量经腹腔感染家兔6只。在家兔感染前后分别采集精液，-40℃冻存备用，分别用普通PCR检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA。结果5只家兔在感染后的8～14d死亡，仅1只家兔在感染后的8d和72d，用PCR检测手段在精液中均可检测到弓形虫DNA。结论弓形虫感染雄兔精液中有虫体存在。     

脑脊液中弓形虫循环抗原的组分分析

本文在国内首先应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ对弓形虫循环抗原（ＣＡｇ）阳性脑脊液标本进行抗原组分分析，并用正常人脑脊液、ＲＨ株弓形虫速殖子的代谢抗原（ＭＡ）及细胞质抗原（ＣＡ）作为平行对照。结果显示，脑脊液及ＲＨ株ＭＡ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白区带范围均在１４～１０８ｋＤ处，在３８～６７ｋＤ处有明显的电泳区带。ＥＬＩＢ反应后均在５０ｋＤ处出现明显的反应区带。从而证实，脑脊液标本中的ＣＡｇ为弓形虫虫体在宿主体内增殖的代谢及裂解产物。同时提示，酶联免疫印迹技术（ＥＬＩＢ）可代替弓形虫的病原学检查，以作为弓形虫病急性、活动性感染的确诊指标。     

急性弓形虫病兔循环抗原动态的实验观察

用Dot-ELISA观察人工感染2株不同剂量的弓形虫家兔血清循环抗原(CAg)动态。结果感染RH株弓形虫速殖子10~4/只和10~2/只的两组家兔,CAg出现和全部阳转时间均在感染后3d。但RH株的感染量影响宿主血清CAg动态。感染PP株10~6/只和10~4/只的两组家兔,血清CAg变化无明显差异。RH株CAg水平变化急骤,而PP株变化较平缓,表明宿主血清CAg动态与弓形虫虫株毒力密切相关。     

弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化

目的检测弓形虫感染家兔精液中虫体DNA,观察虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集精液,-40℃冻存备用,采用两种方法提取精液中总DNA,用实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,QRT-PCR)检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与精液中虫体含量的动态曲线图。结果16只雄兔感染前其精液中均不能检测到弓形虫DNA,精液中虫体含量在感染后7wk左右达到高峰期,然后虫体含量逐渐下降。在感染9wk~15wk维持较低水平。结论弓形虫感染雄兔精液中虫体含量随感染后时间不同而变化。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

Detection of circulating Toxoplasma gondii antigens by the dot-ELISA method

Dot-immunobinding technique was used to detect circulating Toxoplasma antigens in the sera of men and animals. Serum samples were collected from mice and rabbits infected experimentally with parasites of the RH strain of T. gondii while human sera were obtained from persons suspected of having active toxoplasmosis. Circulating Toxoplasma antigens were detected in the samples of mice sera that had been collected since the 2-nd day of infection and in the sera of rabbits during 2 and 3 week of infection. From amongst 146 human sera, 35 (24%) gave positive reaction in the test while 14 (9,5%) produced doubtful results. The experiments proved the method to be sensitive, reproducible and easy to perform. It obviates the need of special equipment while most of the necessary reagents are commercially available. High percentage of doubtful results is the main drawback of the method.