抗猪隐孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

目的筛选特异性强、亲和力高的抗猪隐孢子虫(Cryptosporidiumsuis)单克隆抗体(McAb),并探讨其生物学活性。方法将纯化的猪隐孢子虫卵囊冻融和超声波处理后免疫BALB/c小鼠,取阳性免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;经间接ELISA法筛选,有限稀释法进行克隆;用间接ELISA叠加试验、间接免疫荧光试验鉴定McAbs的免疫反应活性。结果获得3株能稳定分泌抗猪隐孢子虫McAbs的杂交瘤细胞株,命名为1E1C5、1E11A5、2B7A1,分别属于Ig M、IgG3和IgG2a类;其细胞培养上清效价分别为1∶3200、1∶1600和1∶3200,小鼠腹水效价分别为1∶1.6×105、1∶1.6×105和1∶0.8×105;ELISA叠加试验表明3株单抗可识别两个不同抗原位点,1E1C5有较高的亲和力;免疫荧光试验结果显示3株单抗均能与猪隐孢子虫卵囊壁反应,但与艾美耳球虫、人隐孢子虫(C.hominis)有微弱的交叉反应。结论获得了3株可识别猪隐孢子虫卵囊壁的McAbs,为进一步开展猪隐孢子虫快速诊断研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫抗原蛋白cDNA的克隆和表达

以前的研究表明口服抗隐孢子虫的特异性的单克隆抗体,高度免疫血清或牛的初乳可以预防鼠、牛及人的感染。保护性单克隆抗体及来自被感染的人或动物的血清、初乳,可以识别卵囊和子孢子抗原。用隐孢子虫感染的人或动物的血清及初乳以及用隐孢子虫卵囊或子孢子蛋白免疫奶牛而获得的初乳均可识别15kDa天然蛋白。CP15在子孢子的保护性免疫上起支持作用,对CP15特异的McAb可以改善感染隐孢子虫小鼠的状态。本文通过分子克隆表达重组的CP15,并制备对CP15有特异性的高度免疫血清和初乳以应用于隐孢子虫病的免疫治疗。     

抗日本血吸虫卵单克隆抗体的制备和免疫化学的鉴定

用可溶性日本血吸虫卵抗原(SEA)免疫小鼠制备单克隆抗体,获得5株特异的抗日本血吸虫卵单抗。免疫球蛋白亚类鉴定均为IgG_1。免疫印迹法结果表明其所识别的日本血吸虫卵抗原的分子量分别为>200kDa、116kDa和22kDa。经两维免疫印迹法(2-Dimensional Western Blot),显示被单抗IE1识别的22kDa SEA等电点pI4.6—6之间至少有3个以上同晶型体(isomorphs)。放射免疫沉淀试验表明IE1可识别30kDa抗原。     

抗猪囊尾蚴单克隆抗体的初步研究

为了对囊尾蚴病的免疫诊断提供有价值的单在隆抗体（McAb)，我们应用杂交瘤技术，通过对骨髓瘤细胞NS－1与用猪囊尾蚴囊液抗原免疫的BALB／C小鼠脾细胞融合试验及反复筛选和多次克隆化，建立了3株分泌抗猪囊尾蚴抗原的McAb杂交瘤细胞株1D4、4E11和4E12。其分泌的抗体具有很强的种的特异性，与细粒棘球蚴和肥颈绦虫囊尾蚴抗原均不发生交叉反应。免疫球蛋白亚类鉴定表明3株均属IgG1。经蛋白质转移电泳试验（Western blot)确定，与所获McAb发生特异反应的抗原是猪囊尾蚴头节囊壁（SCW）抗原分子量为25kDa和17kDa的蛋白组分。     

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV-RNaseH)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立能稳定分泌抗乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2(HBVRNaseH1及H2)重组蛋白单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法用重组HBVRNaseH1及H2蛋白为抗原免疫BALB/c/小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经有限稀释克隆3次后制备分泌McAb的杂交瘤细胞株,并用酶免疫(EIA)法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果融合后的阳性克隆中筛选出4株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,命名为H1C6、D3;H2E2、F4。这4株McAb与HBVRNaseH1及H2重组抗原均有良好的反应性,杂交瘤培养上清的EIA抗体滴度为1∶100～1∶200,其中2株诱生的同系小鼠腹水滴度为1∶800,1∶1000。这4株McAb均为IgG1亚型。结论该McAb的制备,可为HBV感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。     

抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用

目的制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体（McAb），为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定McAb亚类和效价；通过SDS—PAGE和Western blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目；利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点。结果筛选出3株（4810、283、1H6）特异性较好的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示，283、1H6产生的MeAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30kDa处，4810反应带主要在22kDa处；283，1H6，4810MeAb的效价（ELISA）分别为：1：102400、1：51200、1：12800；283、1H6为IgM，4810为IgG2b；3株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀，表面出现缺口和空洞，虫体变形破碎、膜变厚。抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a—ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白。结论抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用，能准确识别P30抗原，可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制。     

抗日本血吸虫未成熟虫卵单克隆抗体的制备和鉴定

采用日本血吸虫来成熟卵抗原（SIEA）免疫BALB／c小鼠，制备抗SIEA单克隆抗体。获得一株强阳性、高特异的抗未成熟虫卵的单抗（2B2），免疫球蛋白为IgG1类。免疫印迹分析表明该单抗单一识到日本血吸虫未成熟虫卵抗原中的50kDa分子。免疫荧光染色表明，与雌虫子宫内虫卵呈现强阳性反应，而不与成虫抗原交叉。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原P30单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用IFAT进行单抗识别的抗原定位,并通过SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果获得了两株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3和G2,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。2株单抗均属IgG1亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

抗微小隐孢子虫单克隆抗体免疫保护作用的研究

目的：探讨抗隐孢子虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的免疫保护作用。方法：在细胞培养的基础上进行体外中和试验,筛选具有保护作用的ＭｃＡｂ,并通过大鼠及ＭＤＣＫ细胞接种隐孢子虫子孢子（ＣＰＳ）进行动物实验和受染ＭＤＣＫ细胞透射电镜观察证实。结果：Ｚ３Ｄ２可显著降低ＣＰＳ在大鼠肠粘膜表面定植的隐孢子虫虫体及卵囊数。可使隐孢子虫各发育期的虫体减少,使ＭＤＣＫ细胞的超微结构受损减轻。结论∶ＭｃＡｂＺ３Ｄ２具有良好的保护作用。     

旋毛虫部分抗原表位的识别与分析

[目的 ]筛选旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位。 [方法 ]采用杂交瘤技术 ,获得 15株特异性单克隆抗体 ,随后用酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫印迹法 (Westernblotting)和间接免疫荧光试验(IFA)对部分免疫显性抗原进行分析。 [结果 ]Westernblotting试验显示 ,6株单抗与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原反应显示有特异条带 ,分子量为 40～ 70kDa ;而多抗血清则可识别 2 0～ 2 0 0kDa之间 10条条带。IFA可观察到 ,6株单抗中有 4株单抗的靶抗原定位在旋毛虫肌幼虫表皮层上 ,另 2株定位于杆状体 (stichosome)及表皮层。 [结论 ]识别与分析部分旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位 ,为纯化旋毛虫的抗原及疫苗靶抗原的研制提供了有价值的实验依据。     

Comparative study of the antigenic composition of oocyst isolates of Cryptosporidium parvum from different hosts

An investigation was made of the antigenic composition of oocyst isolates of Cryptosporidium parvum by immunoblotting using rabbit polyclonal or murine monoclonal antibodies (MoAbs) developed against this parasite. Using the polyclonal antibodies in blots, a common antigenic profile was obtained from a number of human oocyst isolates from AIDS patients and immunocompetent children in the UK and Portugal. Antigenic differences were observed, however, between a human isolate from Turkey and these other human isolates. The antigenic profiles of oocyst isolates from deer and cattle were similar, but the profiles of the animal and human isolates differed to some extent. Two MoAbs which, in immunofluorescence microscopy, reacted with the surface of the C. parvum sporozoite were also used in blots. A major antigen(s) from 9 of 11 human oocyst isolates recognized by these MoAbs had a molecular weight of 47 kD, but the sizes of the corresponding antigens of the remaining 2 human isolates, one from Turkey (same as above) and one from the UK, were 45.5 and 51 kD, respectively. The equivalent antigen(s) from 4 bovine and 4 ovine isolates was 48 kD. One of the MoAbs failed to react in blots with 2 of the isolates, 1 human and 1 bovine.     

Characteristics and specificity of hybridoma antibodies against oocyst antigens of Cryptosporidium parvum from man

Hybridoma antibodies (HAbs) against oocyst antigens of a human isolate of Cryptosporidium parvum were developed by fusion of SP2/0 mouse myeloma cells and spleen cells from BALB/c mice immunized with oocyst homogenates. In an indirect immunofluorescence antibody test (IFAT), using as antigen a mixture of air-dried sporozoites and oocysts, HAbs labelled either the oocyst wall or areas of the sporozoite, including the whole organism, the entire surface, a polar region or the interior. Most of the HAbs were specific for the sporozoite surface, and few of them recognized the oocyst wall. In Western blot analysis of oocyst antigens, sporozoite surface-reactive monoclonal antibodies (MoAbs) recognized one or more of seven polypeptide bands with molecular weights in the range 47- greater than 200 kD, and all reacted with the 47 kD band. Each of four heterologous parasite isolates had a unique recognition pattern with a panel of MoAbs in IFAT, suggesting antigenic differences may exist between strains of C. parvum. The ability to differentiate between parasite isolates by immunological methods might be of value in epidemiological studies of cryptosporidiosis.     

Staging of leukemic progenitor cells in acute myeloid leukemia by phenotyping with myeloid monoclonal antibodies

We studied the immune phenotype of leukemic progenitor cells (AML-CFU-L) in 16 cases of acute myeloid leukemia (AML) using 12 myeloid monoclonal antibodies (McAbs) in a complement-mediated cytotoxicity assay. On the basis of their reactivities with normal day-14 (D14) and day-7 (D7) myeloid progenitor cells (CFU-GM), these McAbs could be classified into three groups: six McAbs reacted strongly with "early" antigens on D14-CFU-GM, two McAbs reacted only with "late" antigens on D7-CFU-GM, while four McAbs formed an "intermediate" group that reacted both with the "late" antigens on D7-CFU-GM and to some extent with the "early" antigens of D14-CFU-GM. The McAbs all reacted with antigens on AML-CFU-L:McAbs that reacted with "early" antigens reacted consistently strongly with AML-CFU-L, in contrast to McAbs in the two other groups, which displayed greater heterogeneity. On the basis of antigenic phenotype, the predominating CFU-L in AML could thus be placed in one of three "stages." This phenotypic "staging" of AML correlated with the French-American-British (FAB) morphological classification of AML. The AML-CFU-L of patients with FAB morphological types M2, M4, and M5 expressed more differentiated antigenic phenotypes than those of the three patients with M7. The latter reacted poorly with the "intermediate" and "late" McAbs. Our data and those of others suggest that classification based on AML-CFU-L antigenic profile may complement the FAB classification of AML.     

分泌抗新疆出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文报告了用新疆出血热病毒免疫BALB/c鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0融合后建立了6株分泌抗XHF病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞。经传代一年余,分泌抗体的稳定性良好,细胞培养液中抗体滴度可达10~(-3);胶水中滴度达10~(-5)～10~(-6)以上。这6株McAb已成功地用于ELISA、IFA和RPHA。在初步研究中观察到分泌IgM免疫球蛋白的14B_7株McAb致敏醛化血球测定病毒抗原性的灵敏度最高;而8E_(12)和13C_6用于间接免疫荧光时其荧光滴度和亮度最好。表明了同一株McAb在不同的血清学试验中所表现出的亲和性及结合力不完全一致。     

抗环子孢子蛋白保守II+区单克隆抗体的制备及鉴定

目的　获得针对恶性疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)保守II⁺ 区 (RegionII⁺ )的单克隆抗体。　方法　采用恶性疟原虫保守II⁺ 区十二肽 (EWSPCSVTCGNG)免疫BALB/c小鼠 ,经融合 ,ELISA 3次筛选 ,获得 3株分泌针对保守II⁺ 区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。　结果　ELISA检测结果显示单抗能与重组表达的恶性疟原虫CSP片段及天然CSP特异性反应。间接荧光抗体检测显示 ,单抗不仅能识别恶性疟原虫子孢子 ,也能识别约氏疟原虫子孢子。　结论　成功地获得了针对恶性疟原虫CSP保守II⁺ 区的单克隆抗体。     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备诺如病毒衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为诺如病毒的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法用分别表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白的重组腺病毒联合免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度针对衣壳蛋白的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接ELISA、间接免疫荧光和Western-blot检测单克隆细胞株的特异性。结果通过细胞融合和克隆化,筛选出4株分泌抗衣壳蛋白的杂交瘤细胞株V1E、V1E9、V1D6和V6D6。间接ELISA、免疫荧光和Western-blot检测结果表明,V1E和V1E9可以与GGII4型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应,V1D6和V6D6可以同时与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应。结论获得了诺如病毒特异性单克隆抗体,为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。