我国山丘,平原疫区利什曼原虫分离株kDNA分析

为鉴别我国山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株，采用内切酶ＡｌｕＩ对其ＫＤＮＡ进行酶切。结果显示实验各株均有５００ｂｐ片段；Ｌ．ｄ．汶川人株、Ｌ．ｄ．四川人株、Ｌｄ．甘肃人株（ＧＳ２）、Ｌ．ｄ．四川株株、Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ及Ｌ．ｄ．Ｊｅｄｄａｈ具有２１０ｂｐ片段；Ｌｄ．四川人株、Ｌｄ甘肃人株（ＧＳ２）及Ｌｄ四川犬株具有１２０ｂｐ片段；Ｌｄ汶川人株、Ｌ．ｄ．甘肃人株（ＧＳ２）和Ｌｄ．四川犬株具有４００     

我国山丘、平原疫区利什曼原虫分离株kDNA分析

为鉴别我国山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株，采用内切酶AluⅠ对其kDNA进行酶切。结果显示实验各株均有500bp片段；L．d．汶川人株、L．d．四川人株、L．d．甘肃人株（GS2）、L．d．四川犬株、L．infantum及L．d．Jeddah具有210bp片段；L．d．四川人株、Ld．甘肃人株（GS2）及L．d．四川犬株具有120bp片段；L．d．汶川人株、L．d．甘肃人株（GS2）和L．d．四川犬株具有400bp和280bp片段。L．d．甘肃犬株也具有400bp片段；L．infantum和L．d．Jeddah具有280bp片段。提示山丘疫区不同分离株的kDNAAluⅠ酶切片段相近，其中人株与犬株的相似；山丘疫区分离株与平原疫区分离株的酶切片段之间有较大差异，山丘疫区分离株与L．infantum的酶切片段之间既有相似又有差异。     

我国山丘疫区和平原疫区利什曼原虫分离株基因组DNA基因型分析

目的：分析我国山丘和平原疫区利什曼原虫分离株基因组DNA（nDNA）的多态性。方法：对基因组DNA进行内切酶酶切、Southern杂交、染色体定位。探针采用地高辛标记。结果：采用gp63探针，显示杜氏利什曼原虫（Leishmaniadonovani，L．d．）江苏人株和L．d．Jeddah nDNA之间有相似的染色体杂交带，L．d．四川人株和L．infantum nDNA之间有相似的染色体杂交带；采用β－tubulin探针，显示L．d．江苏人株与L．d．Jeddah nDNA之间有两条相似的染色体杂交带，L．d．四川犬株与L．d．甘肃犬株nDNA之间有三条相似的染色体杂交带、与L．d．汶川人株nDNA之间有两条相似的染色体杂交带。结论：提示平原疫区的江苏人株与L. d. J eddah 之间存在同源性, 山丘疫区的L. d. 四川人株与L. infantum 之间存在同源性, L. d. 四川犬株与L. d. 甘肃犬株之间存在同源性、与L. d. 汶川人株之间既存在同源性又存在差异, 山丘疫区与平原疫区分离株之间存在异源性。     

中国利什曼原虫分离株分子核型分析

目的：通过核型分析探讨中国利什曼原虫分离株遗传变异情况。方法：应用脉冲电泳技术对16株中国利什曼原虫分离株基因组核型进行分析。结果：被测分离株分有14条－26条染色体（低于2200kb）被区分，核型差异大多集中于225kb－850kb染色体区域，较大染色体相对保守。其中14株属于杜氏利什曼原虫复合体的分离株存在明显的种内核型差异，但来自同一流行区的分离株核型显示差异较小。所有杜氏利什曼原虫复合体的分离株均含有11条相似染色体带：320kb,350kb,380kb,870kb,910kb,1070kb， 200 kb, 1 250 kb, 1 350 kb, 1 600 kb 和1 900 kb。其中, 从白蛉体内分离出的771 分离株核型显示较为独特, 共分离出26 条染色体带。另两株从大沙鼠体内分离的、先前已分被命名为沙鼠利什曼原虫和都兰利什曼原虫的R12 和R20 分离株显示相近核型。结论: 中国杜氏利什曼原虫复合体内存在明显种内遗传变异, 但亲缘关系越近的分离株核型也越相近。地理环境与媒介白蛉均对杜氏利什曼原虫复合体内遗传变异起一定作用。R12 和R 20 分离株倾向于属于同一个种或两个亲缘关系极近的种。同时, 可见寄生的哺乳动物宿主不同可能与利什曼原虫遗传关系密切。     

我国内脏利什曼病山丘疫区与平原疫区利什曼原虫SSUrDNA多变区序列分析

[目的 ]分析我国内脏利什曼病 (VL)山丘疫区与平原疫区利什曼原虫 (L .d )分离株小亚基核糖体DNA (SSUrDNA)多变区的序列差异。 [方法 ]nDNA进行PCR扩增 ,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于 pGEMR TEasyVector上 ,采用通用引物M 13进行PCR扩增 ,全自动测序仪测序。 [结果 ]序列分析显示 ,扩增的 5株利什曼原虫SSUrDNA序列大小均为 392bp ;序列差异均发生在两个独特序列区 (UQ Ⅰ和UQ Ⅱ ) ;山丘疫区L .d甘肃分离株和四川分离株均在UQ Ⅱ区上有 2个相同的碱基突变 ,L .d甘肃分离株UQ Ⅰ区上有 1个碱基突变 ;无移码突变。 [结论 ]山丘疫区分离株与平原疫区分离株之间的碱基序列有差异 ,平原疫区L .d山东分离株与婴儿利什曼原虫 (L .infantum)的碱基序列相同     

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。　结果　用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。　结论　获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。     

我国山丘疫区杜氏利什曼原虫LACK保护性抗原基因克隆和序列分析

利什曼原虫的LACK抗原是利什曼原虫的蛋白激酶C受体的同源物 ,是新发现的一种抗原蛋白。本实验用分子克隆的方法获得我国山丘疫区杜氏利什曼原虫编码LACK保护性抗原的基因片段 ,测序并对其序列分析比较。我国山丘疫区杜氏利什曼原虫 (L dSC10 )LACK抗原基因片段的大小为 94 2bp ,与GenBank中LACK的核苷酸序列一致性在 94 %以上 ,呈高度同源性 ;推导的氨基酸序列与GenBank中LACK的氨基酸序列一致性达 95 %以上 ,具有高度保守性 ;该蛋白质属于WD蛋白家族 ,有重要的生物学意义。     

我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR-SSCP分析

目的： 分析我国不同类型流行区内脏利什曼原虫 （Ｌ．ｄ．） 分离株ｋＤＮＡ。方法： 应用利什曼原虫属特异引物１３Ａ, １３Ｂ及据杜氏利什曼原虫四川人分离株ｋＤＮＡ 微环特异片段序列设计合成的引物Ⅰ、引物Ⅱ, ＰＣＲ扩增不同流行区利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 获特定片段, 进行ＳＳＣＰ分析。结果： 用引物Ⅰ和引物ⅡＰＣＲ扩增内脏利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 在同样试验条件下, 山丘地区和荒漠地区Ｌ．ｄ． 分离株扩增出２９７ ｂｐ 特定片段, 而平原地区Ｌ．ｄ．分离株及新疆皮肤利什曼原虫未扩增出２９７ ｂｐ 特定片段。将上述各虫株的２９７ ｂｐ 特定片段进行ＳＳＣＰ分析, 可见两个山丘地区的Ｌ．ｄ．分离株ｓｓＤＮＡ 迁移率相同, 而与荒漠地区新疆７７１分离株则相差较大。用引物１３Ａ, １３ＢＰＣＲ 扩增平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株、山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株、Ｌ．ｄ．甘肃分离株,均扩增出１２０ ｂｐ 特定片段。经ＳＳＣＰ分析,平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株的ｓｓＤＮＡ迁移率完全相同; 山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株和Ｌ．ｄ． 甘肃分离株ｓｓＤＮＡ迁移率相同, 但与平原地区者明显不同; 婴儿利什曼ｓｓＤＮＡ迁移     

利什曼原虫K26序列应用于我国利什曼原虫分离株鉴定的价值分析

目的评价利什曼原虫K26序列应用于我国利什曼原虫分离株鉴定的价值。方法收集我国不同流行区的利什曼原虫16个分离株和6个国际参照株,培养后收集前鞭毛体,提取DNA,扩增K26序列并测序,应用ClustalX2进行序列比对,从GenBank下载同源性较高的利什曼原虫分离株的K26序列,构建系统进化树,分析我国不同流行区的利什曼原虫分离株的亲缘关系。结果我国16个利什曼原虫分离株和国际参照株DD8均扩增出单一条带,而5个非杜氏利什曼原虫复合体虫株均未扩增出任何条带。序列分析结果表明,我国人源型利什曼病流行区的3个分离株801、KS-2和KS-6均扩增出920 bp片段,自然疫源型利什曼病流行区的4个分离株XJ771、JIASHI-1、JIASHI-2和JIASHI-5均扩增出491 bp片段,人犬共患型利什曼病流行区4个分离株Cy、SC6、Hebei-Lv和Shanxi-Yang均扩增出404 bp片段,皮肤利什曼病流行区的5个分离株KXG-Xu、KXG-Liu、KXG-65、KXG-918和KXG-927均扩增出449 bp片段,且各流行区内虫株间的序列一致性均为100%。各流行区之间的虫株间的序列一致性较低,为40.2%~91.4%。系统进化树分析结果显示,我国16个利什曼原虫分离株聚集成2个群3个亚群,其中KXG-Xu、KXG-Liu、KXG-65、KXG-918、KXG-927、XJ771、JIASHI-1、JIASHI-2、JIASHI-5分离株聚集为A亚群,Cy、SC6、Hebei-Lv、Shanxi-Yang与婴儿利什曼原虫聚集为B亚群,A亚群和B亚群聚集为Ⅰ群;801、KS-2和KS-6分离株与杜氏利什曼原虫聚集为C亚群,进一步与国际参照株DD8聚集为Ⅱ群。结论利什曼原虫K26序列可应用于我国利什曼原虫分离株的鉴定。     

婴儿利什曼原虫的基因和染色体

本文综合了已获得的婴儿利什曼原虫基因的组成和表达的资料。对比分析发现:1)含有保守的编码区和趋异的非翻译区的串联基因;2)基因表达的多顺反子转录和转录后调节。脉冲场电泳显示:婴儿利什曼原虫染色体同时存在着大小和数目的多样性及高度保守的物理连锁群。婴儿利什曼原虫分子核型的基因谱则证实了其基因(至少是进化保守基因)在染色体上分布的假设。     

新疆克拉玛依地区几株利什曼原虫分离物的同源性分析

目的：确定新疆克拉玛依皮肤利什曼病患者和硕大白蛉吴氏亚种体内利什曼原虫的种。方法：通过酶切电泳及ＤＮＡ杂交的方法对当地病人体内和蛉体内的利什曼原虫以及参考虫株的ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ的同源性分析，研究克拉玛依病人和蛉体内利什曼原虫的基因型。结果：经ｎＤＮＡ基因型分析，表明病人与蛉体内原虫与婴儿利什曼原虫同源性大。结论：当地皮肤利什曼病的病原体为婴儿利什曼原虫，硕大白蛉吴氏亚种为该病的媒介。     

利什曼原虫中国分离株SSUrDNA多变区序列分析

目的分析我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株的SSUrDNA多变区序列差异。方法nDNA进行PCR扩增,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于pGEMR-TEasyVector上,采用通用引物M13进行PCR扩增,全自动测序仪测序。结果序列分析显示本文报道的荒漠、山丘疫区的2株利什曼原虫（L.d.XJ771、L.d.SC6）的SSUrDNA序列大小均为392bp;序列差异发生在两个独特序列区（UQ-Ⅰ和UQ-Ⅱ）,无移码突变;与GeneBank中的利什曼原虫比较分析,同源性在98%以上。结论我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株之间的SSUrDNA多变区的碱基序列有差异;荒漠疫区分离株L.d.XJ771与国际标准株L.d.DD8的SSUrDNA多变区的碱基序列完全相同。     

硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆与序列分析

[目的 ]克隆硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因序列。 [方法 ]应用核苷酸序列数据库 (GenBank)和表达序列末端片段数据库 (dbEST)的计算机检索与DNA文库的杂交筛选方法。 [结果 ]从dbEST数据库中获得一段 30 9nt的来源于硕大利什曼原虫的基因片段 ,据此设计探针 ,筛选硕大利什曼原虫的DNA文库 ,获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因。其开放读码框架由 5 5 2个核苷酸组成 ,编码产物由183个氨基酸残基组成。序列分析表明 ,硕大利什曼原虫与锥虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性为 2 3 5 %。 [结论 ]克隆的基因系硕大利什曼原虫表面蛋白编码基因 ,即无鞭毛体蛋白的编码基因。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆墨西哥利什曼原虫（Ｌ．ｍｅｘ）ＷＲ９７２株的无鞭毛体蛋白（ａｍａｓｔｉｎ）的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法 根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫ＷＲ９７２株的基因组ＤＮＡ作为模板,进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增。将扩增的ＤＮＡ片段克隆到ｐＣＲ２．１Ｔ载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较