日本血吸虫童虫培养细胞超微结构动态变化的研究

随着培养时间的延长，日本血吸虫童虫培养细胞的超微结构发生一系列渐进性变化，主要表现在：核中异染色质含量逐渐增加，由０ｄ时的显著少于常染质转变为５４ｄ时的高于常染色质，线粒体逐渐变性，嵴由清晰变为模糊以至消失，基质电子密度降低，最终成为空泡；内质网由环状变为短管状，囊泡状，最后消失。     

日本血吸虫童虫培养细胞超微结构动态变化的研究

随着培养时间的延长，日本血吸虫童虫培养细胞的超微结构发生一系列渐进性变化，主要表现在：核中异染色质含量逐渐增加，由０ｄ时的显著少于常染质转变为５４ｄ时的高于常染色质；线粒体逐渐变性，嵴由清晰变为模糊以至消失，基质电子密度降低，最终成为空泡；内质网由环状变为短管状、囊泡状，最后消失。日本血吸虫童虫培养细胞中线粒体和内质网超微结构的这些变化，可以用来判断培养条件的优劣；而从染色质的一系列变化推断，０～１８ｄ是诱导培养细胞发生增殖的最佳时期。     

正交试验法研究日本血吸虫童虫细胞的培养条件

本研究首次运用正交试验法探讨日本血吸虫童虫细胞的培养条件，以细胞存活时间为指标，对细胞培养过程中的平衡盐溶液、合成培养基及血清浓度诸因素进行了初步研究，结果表明：A2B1C3为最佳组合。即RP－MI－1640，5％小牛血清和0．85％生理盐水，细胞存活时间长达7个月。     

日本血吸虫童虫细胞体外培养条件的初步研究

目的 探讨日本血吸虫童虫细胞体外培养条件。方法 选取转铁蛋白、核苷酸、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、黄体酮以及非必需氨基酸与维生素组合等5种促进细胞增殖的因子作为考察因素，每种因素选取添加与不添加两个水平，采用正交设计，以RPMI-1640为基础培养液，配制16种条件培养基对日本血吸虫童虫细胞进行体外培养，通过动态观察和AKP组化染色法及直观法分析法获得不同培养条件影响细胞增殖和细胞活力的结果。结果 第2，4，9，13，14孔中的组织出现明显的细胞增殖现象，其细胞AKP检测值也相应较高，各孔中培养细胞的AKP值经直观分析表明：促进细胞增殖最佳因素组合为C181A1，即转铁蛋白、核苷酸、b-FGF。结论 转铁蛋白、核苷酸、b-FGF对日本血吸虫童虫细胞增殖具有明显促进作用。     

日本血吸虫童虫保护性单克隆抗体的建株和鉴定

本研究获8株抗日本血吸虫(中国大陆株)童虫的单克隆抗体,从中确定一株具有体内保护性功能的单克隆抗体(编号为N15D9),其保护率范围为14-39％。经间接免疫荧光法和ELISA试验检测,N15D9能与尾蚴、3h龄机械转化童虫和5d龄肺童虫的表膜抗原反应。经3h龄机械童虫可溶性抗原的免疫印迹法分析,N15D9能识别132、96和10kDa抗原分子。     

紫外线减毒日本血吸虫尾蚴和童虫免疫小鼠的抵抗力研究

本文报告用２５条、５０条、１５０条和３００条紫外线减毒日本血吸虫尾蚴钻皮免疫或减毒童虫皮下注射免疫均能诱导小鼠产生有效的抗攻击感染抵抗力。以２５条免疫量为例，尾钻皮及童虫皮下注射后的减成虫率分别为７２．１％和７０．４％，肝脏减卵率分别为６９．４％和５７．４％，小肠组织减卵率分别为７６．６％和８０．５％，免疫后的有效保护期为７．５个月。     

日本血吸虫肺期童虫收集方法的实验研究

目的建立一种收集纯净肺期童虫的方法。方法用日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21天解剖,从皮肤、肺脏、肠系膜静脉及肝门静脉处收集童虫。结果肺期童虫出现的高峰期为感染后第3天,获得最佳收获肺期童虫的时间,建立了回收大量纯净童虫的方法。     

恒稳电磁场对体外培养的日本血吸虫童虫细胞LDH的影响

目的以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为评价指标,探讨恒稳电磁场对感染21d虫龄的日本血吸虫童虫培养细胞LDH的影响,筛选恒稳电磁场作用的最适强度与时间。方法将虫龄为21d的日本血吸虫童虫细胞接种于小盖玻片上,培养于常规培养基中。接种后第2d,将一部分细胞分别置于强度为0Gs(对照)、5Gs、10Gs、15Gs、20Gs、25Gs的恒稳电磁场中作用48h;另一部分置于20Gs磁场强度中分别作用为0h(对照)、12h、24h、36h、48h、60h、72h。然后运用酶细胞化学方法对日本血吸虫童虫培养细胞进行LDH染色,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照,HIPAS-2000图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果日本血吸虫童虫培养细胞经不同强度恒稳磁场处理后其LDH着色均比对照组深,其中20Gs组的着色最深,其次是15Gs组,再是10Gs组,5Gs组与25Gs组细胞的着色相似,为最浅;统计分析显示,恒稳磁场处理后的各组培养细胞其LDH活性与对照组之间的差异均显著(q5/0=32.7054,q10/0=51.1946,q15/0=74.6917,q20/0=82.5062,q25/0=33.5342,P<0.01);各处理组之间两两比较,除5Gs与25Gs组间差别不显著(q5/25=0.4181,P>0.05)外,其余各组之间差异均有统计学意义(q5/20=49.5414,q5/15=41.4658,q5/10=18.33163,q10/25=18.1466,q10/20=31.3085,q10/15=23.0460,q15/25=41.5878,q15/20=8.5468,q20/25=49.7640,P<0.01)。相同磁场强度作用不同时间后,随着作用时间的延长,细胞的LDH逐渐变深,48h时达到最深,之后逐渐变浅;统计分析表明,不管磁场作用多长时间,培养细胞的LDH活性均明显强于对照组(P<0.01);各实验组之间两两比较亦然。结论恒稳电磁场可以明显增强日本血吸虫童虫细胞的LDH活性,其最佳作用强度与时间分别为20Gs、48h。     

Calpain抗体介导的对日本血吸虫童虫的细胞毒作用

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子———钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)的保护性免疫力和免疫保护性机制。方法　用重组纯化的Calpain抗原免疫小鼠 ,制备抗Calpain血清 ,将机械转化的日本血吸虫童虫和同种鼠激活的嗜酸性粒细胞共同培养 ,观察细胞对血吸虫童虫的黏附及对童虫的杀伤效果。结果　重组Calpain抗原免疫小鼠后 ,产生了极高的抗Calpain特异性抗体 ,并介导了同种鼠的嗜酸性粒细胞对日本血吸虫童虫的黏附。在 3 7°C ,5 %CO2 培养 48h后 ,3 3 .8%的日本血吸虫童虫被杀死 ,与对照组 14 .5 %的自然死亡率相比显著增高 (P <0 .0 1)。结论　Calpain特异性抗体介导了对日本血吸虫童虫的细胞毒作用 ,提示Calpain可能是日本血吸虫的一个疫苗候选分子 ,该分子的重组抗原有可能应用于血吸虫病诊断     

日本血吸虫成虫细胞培养条件的初步研究

本文报道日本血吸虫成虫细胞培养条件的初步研究.结果表明:日本血吸虫的成虫细胞,在合成培养基RPMI-1640和5%的小牛血清、台成培养基TC-199和10%或20%的小牛血清培养液中,在附加常量抗菌素、pH值为7.2—7.4、培养温度为36℃一37℃条件下,其存活时间均可超过150d.另外,成虫细胞在未加抗菌素或附加一定量(常量或两倍于常量)抗菌素的培养液中的存活天数,没有明显差别.     

日本血吸虫成虫培养细胞骨架系统的研究

目的：研究日本血吸虫成虫培养细胞的骨架系统。方法：将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,以RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养,用考马斯亮蓝染色法和魁笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果：考马斯亮蓝染色显示日本血吸虫成虫细胞骨架呈网络状结构,均钭分布于胞质中;用（NH4）2SO4抽提后考马斯亮蓝色显示细胞骨架无明显改变;鬼笔环肽荧光染色后可见细胞内有均匀荧光亮点。结论：日本血吸虫成虫培养细胞骨架呈致密网络状结构,以中间纤维为主,缺乏粗大的微丝束。     

紫外线减毒日本血吸虫尾蚴和童虫免疫小鼠的抵抗力研究

本文报告用２５条、５０条、１５０条和３００条紫外线减毒日本血吸虫尾蚴钻皮免疫或减毒童虫皮下注射免疫均能诱导小鼠产生有效的抗攻击感染抵抗力。以２５条免疫量为例，尾蚴钻皮及童虫皮下注射后的减成虫率分别为７２．１％和７０．４％，肝脏减卵率分别为６９．４％和５７．４％，小肠组织减卵率分别为７６．６％和８０．５％，免疫后的有效保护期为７．５个月。     

PHA诱导日本血吸虫成虫培养细胞增殖的研究

研究PHA对日本血吸虫成虫培养细胞的促增殖作用。方法用浓度为333．3ug／ml的PHA处理日本血吸虫成虫培养细胞24h，在光镜和电镜下观察培养细胞的增殖情况。结果在光镜下发现在老化的培养细胞中间出现一些类似于淋巴母细胞样的新细胞；在光镜和扫描电镜下观察到有呈哑铃状的成对细胞；在透射电镜下观察到有细胞核膜消失，染色质变成粗颗粒状．中心粒一分为二，两中心粒之间还有纺锤丝牵引；还观察到处于分裂早期的细胞，核中染色质浓缩成四块状，核膜有部分消失、结论PHA对日本血吸虫成虫培养细胞有一定的促增殖作用。     

甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞磷酸酶影响的研究

目的 研究甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性的影响。方法 将虫龄26d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上，在RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养第7天时，随机分为实验组和对照组，实验组用含浓度为3μg/mlMNNG的常规培养基处理48h，对照组用不含MNNG的常规培养基处理同样时间，随后换用常规培养基培养3周，当再换用含5％小牛血清的培养基培养1周时，分别用Gomori钙钴法和Gomori硫化铅法对两组培养细胞进行AKP和ACP细胞化学染色，用实验组培养细胞的AKP、ACP活性明显高于对照组培养细胞的活性（P＜0．01）。结论 MNNG能增强日本血吸虫成虫培养细胞AKP、APC的活力，对培养细胞有促生长或／或诱导其转化的作用。     

亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞SDH的影响

目的以琥珀酸脱氢酶(SDH)为指标,探讨亚精胺(Spermidine ,Spd)对日本血吸虫成虫培养细胞生长代谢的影响。方法将24 d龄的日本血吸虫成虫用冷消化法制成细胞悬液,联合法将细胞接种于小盖玻片上培养。培养至第4 d ,一部分细胞用含Spd终浓度分别为0(对照)、25、50、75、80、90、100、150、200μmol/L的无血清培养基处理24 h,另一部分细胞用终浓度为75μmol/L的Spd分别处理0(对照)、12、24、36、48、60、72 h。然后用PBS清洗3次,再换用常规培养基继续培养。至第8 d ,对处理过的培养细胞进行SDH细胞化学染色,Olympus-BH2显微镜下观察、拍照,并将结果输入HPIAS-2000图像分析仪进行图像分析。结果用Spd作用24 h,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随Spd浓度的升高逐渐增强,75μmol/L时达到最高,>75μmol/L,SDH活性逐渐减弱。当Spd作用浓度为75μmol/L时,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随着Spd作用时间的延长逐渐增强,48 h时达到最高,然后逐渐减弱。统计学分析显示,Spd处理后的实验组培养细胞,其SDH活性与对照组细胞比较差异具有显著性(P<0 .05) ;用终浓度为75μmol/L的Spd处理培养细胞48 h,培养细胞的SDH活性显著强于其余各组(P<0 .01)。结论Spd可显著增强日本血吸虫培养细胞的生长代谢活性;用终浓度为75μmol/L的Spd处理48 h,培养细胞的SDH活性最强。     

基质对日本血吸虫培养细胞SDH和LDH影响的研究

目的　研究细胞外基质 (ECM)对日本血吸虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (L DH)代谢活力的影响 ,筛选适合培养细胞存活、生长的生物基质。　方法　将虫龄 2 1d的日本血吸虫细胞接种于预先涂有肝、肺、鼠尾胶等不同生物基质的小盖玻片上常规培养 ,运用酶细胞化学方法 ,在培养第 3d进行 SDH染色 ,第 7d作 L DH染色 ,显微镜观察并拍照 ,图像分析仪测定其含量 ,并作统计分析。　结果　不同 ECM培养的细胞 ,其 SDH、 L DH活性不同 ,着色颗粒颜色按对照组、鼠尾胶组、肺基质组、肝基质组依次加深。定量分析结果显示 ,肝、肺基质组培养细胞 SDH含量与对照组差异显著 (P<0 .0 1) ,而鼠尾胶组与对照组差异不显著 (P>0 .0 5 )。各基质组培养细胞的 L DH含量与对照组比较 ,差异显著 (P<0 .0 1) ;各基质组之间两两比较差异亦具有显著性。肝基质组培养细胞内两种酶含量最高。　结论　肝基质最适合日本血吸虫培养细胞的存活与生长。     

间接荧光抗体试验检测日本血吸虫感染家兔血清中特异性抗体水平的动态变化

用尾蚴、雌虫、雄虫和血吸虫感染兔肝组织内虫卵冰冻切片抗原进行间接荧光抗体试验（ＩＦＡＴ），观察日本血吸虫感染家兔血清中特异性抗体的动态变化。抗尾蚴、成虫（雌、雄虫）、虫卵抗体检出的最早时间分别为３ｗｋ、３ｗｋ、４ｗｋ，其抗体滴度高峰分别在感染后７ｗｋ、１０～１２ｗｋ和１０ｗｋ。以抗尾蚴抗体水平最高，抗虫卵抗体次之，抗雌、雄虫抗体较低。这为全面了解感染宿主对血吸虫各期抗原（尾蚴、雌、雄虫、虫卵）的免疫反应及免疫学诊断提供了新的资料