实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

生理状态下外周血白细胞穿孔素基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立穿孔素(perforin,PFR)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术。方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员生理状态下处周血PFR mRNA的表达。主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性PFR mRNA表达进行定量分析,相关系数r=1。     

ABI Quantistudio Dx实时定量PCR仪HBV-DNA检测的性能验证

 目的 验证ABI Quantistudio Dx实时荧光定量 PCR 仪 HBV-DNA 检测系统的性能。方法 参考 GB/T 22576-2008和CNAS-CL36相关文件,ABI Quantistudio Dx实时荧光定量 PCR 仪检测患者标本、质控品及卫生部临检中心室间参考物质。从以下几个方面进行性能验证:精密度、正确度、线性范围、检出限等。结果 ABI Quantistudio Dx 实时荧光定量 PCR仪 HBV-DNA 检测系统的批内精密度(批内 CV)分别为 2.09%(低浓度)、1.3%(高浓度);批间精密度(批间 CV)分别为3.92%(低浓度)、2.88%(高浓度);准确度评估以参加能力验证/室间质评的项目来判断,项目 PT 成绩为 100%,通过;系统最低检出限为50 U/ml;线性范围验证结果显示,线性回归方程为Y=1.0001X,R²=0.9976。线性范围为 1.00×10²~1.00×10⁸ U/ml。结论 ABI Quantistudio Dx 实时荧光定量 PCR 系统检测 HBV-DNA性能良好,满足临床检测需要。     

实时定量PCR检测隐球菌性脑膜炎中TRAIL表达

目的研究建立实时荧光定量(RFQ)-PCR法测定TRAIL mRNA含量的方法,探讨其在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中表达的检测价值,并分析隐球菌性脑膜炎患者免疫指标与TRAIL的相关性。方法设计特异性的引物和探针,以人基因GAPDH为内参照,用实时定量PCR的方法检测35例健康人和35例隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL mRNA的表达水平,采用特定蛋白分析仪测定IgG、IgA、IgM、C3、C4。结果与健康人比较,隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL mRNA的表达明显下降(P<0.01)。隐脑患者血清中的C3和IgG显著下降(P<0.01),且与TRAIL的变化成正相关。结论隐球菌性脑膜炎患者TRAIL下降,提示TRAIL可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为有效治疗隐球菌性脑膜炎提供了新的线索。     

运用荧光定量PCR检测低氧训练大鼠肝脏ChREBP基因表达

目的:建立碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术.方法:32只SD大鼠随机分为常氧安静组、常氧运动组、低氧安静组和低氧运动组,运动组每天运动1小时,每周运动5天;低氧组每天在低氧下生活10小时.实验6周后取肝组织,应用实时定量PCR方法检测肝组织ChREBP mRNA的表达.结果:实时定量PCR方法可对肝组织ChREBP mRNA表达进行定量检测.ChREBP基因拷贝数与检测阈值呈线性关系,相关系数r＞0.99.结论:实时定量PCR方法检测ChREBPmRNA结果准确、可靠.     

实时荧光定量PCR测定HBV-DNA的方法和临床意义

HBV—DNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。HBV—DNA定量的方法有PCR核酸探针杂交法、R．ELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR，本文综述定量检测HBV—DNA意义及PCR检测方法。     

生理状态下外周血白细胞γ-干扰素基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立γ-干扰素(IFN-γ)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术。方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员生理状态下外周血白细胞IFN-γmRNA的表达。主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性IFN-γmRNA表达进行定量分析,相关系数r>0.99。     

实时荧光定量PCR法检测炭疽杆菌

为建立一种简便而特异的炭疽杆菌检测方法用作临床诊断工具，以nXO1持粒上的pag基因及pXO2质粒上的cap基因为靶合成特异引物，用DNA嵌入荧光染料SYBR Green I进行定量PCR扩增，在PCR后进行熔融曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，定量PCR条件优化结果为：引物浓度0．8umol/L,Mg^2 5.0mmol/L。该法检测炭疽的灵敏度达10^3拷贝，并能区分炭疽杆菌与其他蜡样杆菌，表明实时荧光定量PCR技术能够快速准确，特异地对炭疽进行定量分析。     

生理状态下外周血白细胞IL-2基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立白细胞介素2(IL-2)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术.方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员中IL-2 mRNA的表达.主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性IL-2 mRNA表达进行定量分析,相关系数r>0.99.     

实时荧光定量PCR法在检测泌尿生殖道感染病原体中的应用

目的评价荧光定量PCR（FQ-PCR）在实验室检测泌尿生殖道病原体、淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原体（UU）和沙眼衣原体（CT）中的应用。方法 464例拟诊为泌尿生殖道感染者的临床标本,用培养法检测NG、UU病原体和胶体金免疫层析法检测CT抗原,对同一标本同时用FQ-PCR检测NG、UU或CT的核酸。结果 FQ-PCR和培养法检出NG阳性率分别为28.4%（63/222）和14.9%（33/222）,P〈0.01,检测UU的阳性率分别为41.7%（126/302）和32.5%（98/302）,P〈0.05,FQ-PCR和金标法检测CT阳性率分别为18.2%（57/314）和6.1%（19/314）,P〈0.001,FQ-PCR对3种病原体的检出率均明显高于培养法或金标法。结论 FQ-PCR法检测NG、CT以及UU在临床诊断NG,UU和CT感染中具有重要应用价值,是常规方法的有效补充。     

代谢综合征相关新基因MSRG实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立测定MSRG mRNA表达量的实时荧光定量PCR检测方法,为新基因的功能研究奠定基础.方法 根据MSRG cDNA序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品,建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的灵敏性、特异性和重复性.荧光PCR检测不同浓度葡萄糖[5 6mmol/L(G5.6)、22mmol/L(G22)、33.3mmol/L(G33.3)]刺激人肝癌细胞株HepG2细胞MSRG的表达并与半定量RT-PCR方法进行比较.结果 建立了MSRG mRNA表达的实时荧光PCR检测方法.荧光PCR检测显示G33.3、G22和G5.6组HepG2细胞MSRG表达均有显著差异,半定量RT-PCR方法检测G33.3组MSRG表达显著增加,但不能检测出G22和G5.6组间有差异.结论 本实验建立的MSRG mRNA表达实时荧光PCR检测方法灵敏性、特异性和重复性较好,为MSRG功能的研究提供了一种重要手段.     

亚细胞定位及信号转导检测技术在hrnt_1基因功能研究中的应用

目的 :hrnt_1是本实验室克隆的全长基因 ,GenBankNr库中编号为AF2 2 3393。实验证实该基因与支气管上皮细胞恶性转化相关 ,但具体的生物学功能尚不清楚。本研究旨在建立一种功能研究的方法 ,为探索hrnt_1在细胞恶性转化过程中的生物学功能提供线索。方法 :构建hrnt_1与pEGFP荧光素表达载体 ,通过融合蛋白的表达 ,观察hrnt_1基因产物在细胞中的位置分布 ;利用信号通路检测技术 ,观测hrnt_1对细胞内信号转导通路的影响。结果 :hrnt_1产物主要分布在细胞核中 ,对Myc Max,GR ,NFκB ,EIK_1 STAT等核转录因子活性有上调作用。结论 :细胞定位与信号通路检测技术相结合的方法简便、快速 ,适用于新的疾病基因功能研究。     

实时定量PCR检测GDNF基因转染大鼠BMSCs后的转录水平

目的 了解外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的转录水平.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将其随机分为GDNF基因转染组、空质粒转染组和未转染组3组;GDNF基因转染组和空质粒转染组分别用GDNF基因和空质粒重组腺病毒感染BMSCs,并按感染后培养时间的不同(3、6、9和12天)又分为4个亚组.采用实时定量PCR技术检测GDNF基因在BMSCs中的转录水平.结果 空质粒转染组和未转染组无GDNF mRNA的表达,GDNF基因转染组在转染后3～12天的GDNF mRNA相对表达量为0.007 51±0.000 67.结论 腺病毒介导的基因转染技术将GDNF基因转染至骨髓间充质干细胞中,有外源性基因GDNF mRNA的表达,这为进一步研究以GDNF基因转染的BMSCs治疗中枢神经系统疾病奠定了基础.     

Investigation of telomere lengths measurement by quantitative real-time PCR to predict age

Currently DNA profiling methods only compare a suspect's DNA with DNA left at the crime scene. When there is no suspect, it would be useful for the police to be able to predict what the person of interest looks like by analysing the DNA left behind in a crime scene. Determination of the age of the suspect is an important factor in creating an identikit. Human somatic cells gradually lose telomeric repeats with age. This study investigated if one could use a correlation between telomere length and age, to predict the age of an individual from their DNA. Telomere length, in buccal cells, of 167 individuals aged between 1 and 96 years old was measured using real-time quantitative PCR. Telomere length decreased with age (r=-0.185, P<0.05) and the age of an individual could be roughly determined by the following formula: (age=relative telomere length -1.5/-0.005). The regression (R(2)) value between telomere length and age was approximately 0.04, which is too low to be use for forensics. The causes for the presence of large variation in telomere lengths in the population were further investigated. The age prediction accuracies were low even after dividing samples into non-related Caucasians, males and females (5%, 9% and 1%, respectively). Mean telomere lengths of eight age groups representing each decade of life showed non-linear decrease in telomere length with age. There were variations in telomere lengths even among similarly aged individuals aged 26 years old (n=10) and age 54 years old (n=9). Therefore, telomere length measurement by real-time quantitative PCR cannot be used to predict age of a person, due to the presence of large inter-individual variations in telomere lengths.     

定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的建立一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法。方法采用TaqMan荧光探针技术,针对炭疽芽孢杆菌质粒pXO1、pXO2上的基因设计引物;用炭疽芽孢杆菌（Sterne株）污染环境土壤来模拟实际样本,比较了从土壤中提取DNA的不同方法对检测效果的影响,并与同类进口试剂进行了平行比对。结果以含有检测目的片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度可达到101拷贝/μl;用Sterne株芽孢悬液污染土壤,检测灵敏度可达2.5×103cfu/g土壤。我们研制的试剂与进口试剂在敏感性和准确性方面一致,且操作简便。结论本研究建立的炭疽芽孢杆菌实时定量PCR检测方法可特异、灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌。     

Q-RT-PCR检测LAMC2、KLK6、SNCG在鼻咽癌肝转移细胞中的表达

目的检测LAMC2、KLK6、SNCG等3个基因在鼻咽癌细胞株5-8F-EGFR和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFR中的表达情况,分析这些基因在鼻咽癌肝转移过程中所起的作用。方法采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RT-PCR（Q-RT-PCR）检测5-8F-EGFR和5-8F-H3B-EGFR中LAMC2、KLK6、SNCG等3个基因的表达情况。结论 LAMC2、KLK6、SNCG等3个基因在5-8F-H3B-EGFR中表达均上调,且与5-8F-EGFR比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 Q-RT-PCR能够敏感、特异地检测出5-8F-EGFR和5-8F-H3B-EGFR中mRNA的表达差异,方法准确可靠,操作方便;LAMC2、KLK6、SNCG有可能成为判断鼻咽癌肝转移的潜在分子标志物。     

Monitoring gene expression of rcpA from Aggregatibacter actinomycetemcomitans versus antimicrobial photodynamic therapy by relative quantitative real-time PCR

BackgroundAggregatibacter actinomycetemcomitans is an important pathogen that is frequently found in various infections, particularly aggressive periodontitis. In this study, we described the outcome of the expression level of A. actinomycetemcomitans virulence factor following treatment by antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) with indocyanine green (ICG) as a photosensitizing agent.Materials and methodsTo determine the aPDT effect on the cell-surviving assay and expression ratio of the rcpA gene in A. actinomycetemcomitans by a colony-forming unit and relative quantitative (q) real-time PCR (qRT-PCR) assays, respectively, the proper dosing of sub-lethal aPDT was specified.ResultsThe results of the current study showed that ICG-mediated aPDT, using 250–1000 μg/mL, showed a significant reduction in A. actinomycetemcomitans growth when compared to the control group (P < 0.05). Also, a sub-lethal dose of aPDT against A. actinomycetemcomitans was 125 μg/mL ICG, with a 30 s diode laser irradiation time at fluency of 15.6 J/cm² that could reduce the expression of rcpA gene approximately 6-fold.DiscussionaPDT with ICG could reduce the cell survival and the virulence agent of A. actinomycetemcomitans. Thus, use of the appropriate aPDT dosage can be used for the successful treatment of periodontitis in vivo.     

KLK6 mRNA在乳腺癌中的表达及其临床病理和生物学意义

目的 对正常乳腺组织和癌组织KLK6 mRNA进行定量,分析其表达与临床病理特征的关系,并探讨乳腺癌细胞株MCF-7中KLK6基因被沉默后细胞增殖及凋亡的变化.方法 应用实时荧光定量PCR检测48例乳腺癌切除组织中KLK6基因mRNA的表达量,并分析KLK6 mRNA的表达量与ER、PR及肿瘤转移情况的相关性.以体外化学合成的siRNA干扰乳腺癌细胞株MCF-7中KLK6基因的表达,分析细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化.结果 KLK6 mRNA在73%(35/48)的乳腺癌组织中表达水平增高,明显高于正常组织(P＜0.01),有淋巴结转移的患者癌组织中的表达水平明显低于未转移组(P＜0.05);ER( )组低于ER(-)组(P＜0.05);PR( )组与PR(-)组差异不明显(P＞0.05);与乳腺癌相关基因CerbB-2的表达无相关性(P＞0.05).MCF-7细胞中KLK6基因表达沉默后,S期细胞增加13.23%,细胞凋亡无明显变化.结论 KLK6 mRNA在乳腺癌组织表达增高,并与ER状态及肿瘤转移情况有关.体外MCF-7细胞株和体内移植瘤KLK6基因表达沉默后肿瘤细胞生长加快.提示KLK6基因表达受雌激素下调的影响,是促乳腺癌细胞增殖的抑制因子,从而为乳腺癌的防治提供了新思路.